| 研究課題/領域番号 |
20K10226
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
柄 優至 広島大学, 病院(歯), 助教 (50737682)
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| 研究分担者 |
谷本 幸太郎 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (20322240)
阿部 崇晴 広島大学, 病院(歯), 助教 (20806682)
國松 亮 広島大学, 病院(歯), 講師 (40580915)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 再生医療 / SHED / レーザー |
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| 研究実績の概要 |
ヒトの乳歯歯髄由来 MSCs (SHED)の採取、培養を行い、安定的に採取培養ができる環境および手技を確立した。また、SHEDの表面抗原CD146による骨再生能の比較を行うため、セルソーティングし、それによりCD146陽性細胞を単離することの手技を確立させた。骨欠損部への移植の成功率を向上させるために、メンブレンに被覆したものを作製した。頭頂骨にトレフィンバーを使用し、安定的に5㎜の欠損部を作製できる技術を得た。こうして作成した免疫不全マウス骨欠損モデルを作製し、SHEDを移植したものと、移植していないコントロール群を設定し、動物用μCTを1か月後と2か月後に採得して評価した。コントロール群と比較してSHED移植群において、1か月後および2か月後の骨再生が促進する傾向が認められた。さらに、骨欠損部にレーザー照射を行った群および、骨欠損部にSHEDを移植しレーザー照射を行った群に関しても検討中である。
その他、骨芽細胞やヒト歯肉線維芽細胞を用いて、レーザー照射を行った後に、骨形成マーカー等にどのような変化が起こるかをPCRやウェスタンブロット法等により、検証を重ねている。結果の一つとして、ヒト歯肉線維芽細胞にレーザー照射を行うことで、BMP2やBMP4の骨形成マーカーが上昇するということが解明された。これは、Lasers in Medical Science（2020）に投稿し、誌上に掲載された。（Yuji Tsuka, Ryo Kunimatsu, Hidemi Gunji et al.）
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
歯髄中に含まれるCD73＋CD90＋CD146＋細胞性質の解析については、ヒト乳歯歯髄由来MSCs (SHED)の採取、培養を行い、安定的に採取培養ができる状態を確立することに予想以上に時間がかかっている。また現在、患者からSHEDを採取しており、採取できる機会が減っていたこともあり遅れていると考えられる。
コールドレーザー照射が細胞増殖・基質産生能に及ぼす影響の解明については、条件検討の段階で時間がかかっている。
免疫不全マウスの骨欠損における骨再生能の比較検討については、頭頂骨にトレフィンバーを使用し、安定的に5㎜の欠損部のある免疫不全マウス骨欠損モデルを作製することに予想以上の時間がかかってしまったことから遅れが生じていると考えられる。
全体に実験の進行が遅れていることの、大きな理由としては、ヒト乳歯歯髄由来であるため、ヒトからの採取が必要だが、この機会が少なくなっていたことやモデルの確立が、予想以上に繊細であることがあげられる。
また2020年度は、SHEDの採取状況から、遂行可能な実験から実験１と実験２と実験３を並行して行った。実験１実験２は実験に遅延が生じており、実験３については2021年度の予定を早めて行っている。全て同時進行しており、データや成果としては、遅延を生じてしまったと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
実験1 歯髄中に含まれるCD73＋CD90＋CD146＋細胞性質の解析については、ヒトからの乳歯歯髄由来MSCs(SHED)の採取が今後可能な限り、進めていく予定である。
実験2 コールドレーザー照射が細胞増殖・基質産生能に及ぼす影響の解明については、SHEDおよびマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞株 (MC3T3-E1)の2種の細胞で、808 nmの波長(Sheep ,Unitak)のレーザー照射を主として、円滑に実験が進行するよう実施していくこととする。
実験3 免疫不全マウスの骨欠損における骨再生能の比較検討については、免疫不全マウス骨欠損モデル（当研究グループ独自の手技 (Nakajima K et al., 2018) ）を使用して、SHEDの移植をした群、SHEDの移植にさらにlaser照射した群、レーザー照射のみの群、コントロール群を設定し、骨再生・修復の経日的変化について、μCTを用いて、三次元的に解析を行う。HE染色およびMasson’s trichrome染色を行うとともに、骨代謝関連マーカーの免疫組織化学染色を用いて評価する。上記の骨欠損モデルは安定して作成が可能な状態になっており、速やかな実験遂行が可能であり、4群のデータを検討する予定である。
実験1の進行に遅延が起こっても、実験全体の進行が円滑に遂行されるために、実験2および実験3を主として行い、実験1を並行して行っていくこととする。SHEDが採取できない期間も、実験2のMC3T3-E1細胞の検討や、実験3のレーザー照射群の検討は行うことが可能であるため、このような対策で今後実験を進めていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本実験は、ヒト乳歯歯髄由来MSCs (SHED)を用いるため、患者からの採取が必要であるが、一時期採取できる機会が減っていたことから実験が遅延している。この影響で、In Vivo実験およびIn Vitro実験ともに影響を受けており、各種消耗品の使用が減ったことが大きな理由の一つとしてある。可能な実験から開始しているが、実験全体の遅延から、使用されるべき消耗品が減っていない状況である。また昨年度の情勢から、学会はオンラインでの開催となっており、旅費について余剰が生じていると考えられる。
今年度は、In Vivo実験およびIn Vitro実験ともに円滑に進めていく予定であり、前年度に予定していた実験も合わせて遂行する必要があり、免疫不全マウスや、消耗品等の試薬の使用が2021年度分よりも、多く必要となる。旅費に関しては、実験の遂行具合により発表が可能かまた。その時の情勢により移動が可能かに関わってくるため、不透明である。また、SHEDの採取状況から、遂行可能な実験から行うために、実験１と実験２と実験３を並行して行った。そのため実験１実験２は実験が遅延しており、本来2021年度に行うはずの実験３は進んでいるが、全て同時進行していることから、データ、成果という面では遅延している。2021年度もこれらを並行して行っていく予定であり、今後消耗品の消費が増えていくと考えられる。
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