| 研究課題/領域番号 |
20K10268
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
林 幾江 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (00346503)
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| 研究分担者 |
小原 勝 大垣女子短期大学, その他部局等, 教授 (80253095)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ペプチドグリカン / う蝕 |
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| 研究実績の概要 |
口腔レンサ球菌(Streptococcus mutans, S.sobrinus, S.salivarius, S.sanguinis, S.mitis)の細胞壁ペプチドグリカン構造解析を行った結果、S.sobrinusのみ架橋ペプチド鎖(-Thr-Ala-)のThrにアセチル化修飾を認めた。グリカン鎖のMurNAcアセチル化修飾は数多く報告されているが、Thr残基のアセチル化修飾は私たちが渉猟する限り新規発見である。S.sobrinusのペプチドグリカン架橋アミノ酸・Thr残基のアセチル化を探求するためバイオインホマティクス的方法、分子生物学的方法、生化学的方法を用いて、その詳細解明にアプローチしている。
（１）バイオインホマティクス的方法：NCBIデータベースにアクセスし、S.sobrinus whole genome情報からペプチドグリカン架橋アミノ酸・Thrアセチル化酵素候補遺伝子の同定
（２）分子生物学的方法：（１）の情報より同定された遺伝子候補を用いて(２)-1:Thrアセチル化酵素候補の組み換え体タンパク質発現・精製。(２)-2:S.sobrinus染色体でのThrアセチル化酵素候補遺伝子KO株の作成・形質観察
（３）生化学的方法：S.sobrinusホモジェネート（もしくは膜画分）を粗酵素源として、 ペプチドグリカンもしくはムロペプチドを基質としたin vitroアセチル化反応系を確立。Classicalな正攻法で膜画分からの酵素の可溶化、クロマトグラフィーでの精製。
（４）その他：本研究の目的の1つに「う蝕撲滅」という臨床応用への寄与を挙げている。本研究の関連分野として、う蝕原因菌S.mutans, S.sobrinusの唾液中の検査法、殺菌・静菌法開発への示唆、口腔常在菌叢の制御法へのヒントの提供。上記について、研究分担者と協力し研究続行中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
（１）バイオインホマティクス的方法：S.sobrinus whole genome情報からペプチドグリカン架橋アミノ酸・Thrのアセチル化酵素候補遺伝子Oat2, Oat34を同定した。2つの候補遺伝子を種々の解析ソフトにより解析したところ、(i)11個の膜通過ドメインをN末に持ち、C末部分にSer/Asp/Hisの活性中心を持つacetyltransferaseの可能性が示唆された。(ii)遺伝子候補のphylogenic treeから２つのPG acetyltransferaseを染色体上に持つのはS.sobrinusのみであること。すなわち、1つがグリカン鎖acetyltransferaseで、もう1つが架橋鎖Thr acetyltransferaseであること、が強く示唆された。
（２）分子生物学的方法：（１）の情報より同定された遺伝子候補を用いて（２）-1. Thrアセチル化酵素候補の組み換え体発現・精製：Hydrohobicity解析からOat2は612aa中453番目以降のC末部分を、Oat34は593aa中391番目以降のC末部分を“可溶化できそうな酵素”部として遺伝子クローニングすることを決定した。（２）-2. S.sobrinus染色体でのThrアセチル化酵素候補遺伝子KO株の作成・形質観察：pBGK vector (Plasmid. 2001, 45: 31-6), pMC340B plasmid (Mol Microbiol. 2009, 74: 888-902), pIB102 (Appl Env Microbiol. 2008, 74: 2037-2042)をS.sobrinusのKO株作成toolとして使用するベクターとして選別を終えた。現在、これらのプラスミドを保管する海外の研究室に分与をお願いしているところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）バイオインホマティクス的方法：S.sobrinusペプチドグリカンThr架橋鎖アセチル化酵素候補遺伝子Oat2, Oat34、二つの候補遺伝子産物の立体構造解析ソフトにより、(i)3次元構造予測。(ii)ペプチドグリカンもしくはムロペプチドとの作用点のシミュレーションを行い、さらなる情報を得る。
（２）分子生物学的方法：（１）の情報より同定された遺伝子候補を用いて（２）-1. Thrアセチル化酵素候補の組み換え体発現・精製：Oat2は612aa中453番目以降のC末部分を、Oat34は593aa中391番目以降のC末部分をPCR遺伝子クローニングする。（２）-2. クローニングした遺伝子を大腸菌・酵母・蚕・無細胞系発現系、いづれかにて大量発現、粗精製を行う。（２）-3. S.sobrinus染色体でのThrアセチル化酵素候補遺伝子KO株の作成・形質観察：pBGK vector, pMC340B plasmid, pIB102を入手しS.sobrinusのKO株を作成する。
（３）生化学方法：bioinformaticsで同定した遺伝子産物の活性がなかった場合、基本に立ち返りS.sobrinusホモジェネート（もしくは膜画分）を粗酵素源として、ペプチドグリカンもしくはムロペプチドを基質としたin vitroアセチル化反応系を確立。Classicalな正攻法で膜画分からの酵素の可溶化、各種クロマトグラフィーで精製する。
（４）その他：将来S.sobrinusアセチル化酵素の欠損株、アセチル化酵素の阻害などがS.sobrinusの生存・抗菌剤・溶菌酵素耐性に影響を与えるか？を観察する
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍において学外研究分担者が遺伝子組み換え施設の整った実験室に自由に往来し研究を遂行することが困難になったため組み換えタンパク質発現にかかる酵素等試薬の消耗品購入経費が現有の試薬の使用範囲に抑えられたことと、学会参加や情報収集のための機会がなく旅費支出も抑えられたことにより次年度使用額が生じた。今年度は計画を変更し、研究代表者が組み換えタンパク質発現を担当し、その酵素活性確認等生化学的性状解析も行うこととし、研究の遂行をはかる。そのため、組み換えタンパク発現にかかる情報取集やこれまでに得た結果を積極的に発表するため前年度繰り越した経費は今年度の物品および旅費の経費として執行する予定である。
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