| 研究課題/領域番号 |
20K10278
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
堤 博文 日本大学, 歯学部, 講師 (30188594)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ヒト特異的DNA / Quantifiler Trio / 分解指標 / PCR阻害 / リアルタイムPCR |
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| 研究実績の概要 |
腐敗あるいは陳旧化した試料についてDNA型検査を行う場合、そのDNAの分解度とTotal human genomic DNA（ヒト特異的DNA）の定量値を正確に知ることは、後のDNA型判定に使用する際のDNAを無駄にせず、なおかつ正確に検査することが可能となる。本研究は、PCR阻害に強く、DNAの分解の程度も把握可能なTaqMan法を利用したQuantifiler Trio DNA Quantification Kit(applied biosystems)を用いて、種々の環境下に放置した歯についての経年的変化によるDNAの量を観察し、正確なDNA量を知ることを目的とした。昨年度は、黒土、腐葉土、川砂および赤玉土の環境に、3ヶ月間および6ヶ月間歯を放置し、それらの歯からDNAを抽出した後、Quantifiler Trio DNA Quantification Kitによる、試料DNA中にヒト特異的DNA量およびDNA分解の程度(分解指標：Degradation Index：DI）について検討した。得られたヒト特異的DNA量、分解指数の値を評価した後、Globalfiler PCR Amplification Kit(applied biosystems)を用いて常染色体STR型判定を行った。その結果、各環境下における経時的変化によるDIは3ヶ月間経過後の黒土の場合、平均:2.003、腐葉土では2.168、川砂では2.593および赤玉土1.766であった。また、6ヶ月間経過後のDIは黒土の場合、平均:1.871、腐葉土では3.720、川砂では1.909および赤玉土2.664であった。これら各環境下における試料の分解指数の値は、中程度の断片化、軽度のPCR阻害の可能性が伺われた。しかしこの程度のDIでは、常染色体STR型の検出では、試料すべて検出可能であった
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
試料は当講座所蔵の歯（抜去後20年～30年）を用いて、黒土、腐葉土、川砂および赤玉土の環境に3ヶ月間および6ヶ月間歯を放置し、それらの歯からDNAを抽出した。そのDNAについてQuantifiler Trio DNA Quantification Kit(applied biosystems)を用いて定量および評価を行った後、Globalfiler PCR Amplification Kit(applied biosystems)を用いて常染色体STR型判定を行った。その結果、各環境下における経時的変化による分解指標（Degradation Index：DI）は、3ヶ月間経過後の黒土の場合、平均:2.003、腐葉土では2.168、川砂では2.593および赤玉土1.766であった。また、6ヶ月間経過後のDIは黒土の場合の平均:1.871、腐葉土では3.720、川砂では1.909および赤玉土2.664であった。これら各環境下における試料の分解指数の値は、中程度の断片化、軽度のPCR阻害の可能性が伺われた。しかしこの程度のDIでは、常染色体STR型の検出では、試料すべて検出可能であった。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は昨年度に黒土、腐葉土、川砂、赤玉土および黒土と腐葉土混合の条件に放置した歯について経年的変化、すなわち、放置されてからの年月が1年間経過後および1年6ヶ月間経過後の歯からDNAを抽出し、そのDNAの定量を行う。定量方法は、蛍光色素がDNAに選択的に結合して定量するQubit dsDNA HS Assay KitおよびQubit 1x dsDNA HS Assay Kit、また、昨年度同様に、ヒト特異的DNA配列を標的としたリアルタイムPCR法を利用したQuantifiler Trio DNA Quantification Kitを用いて定量を行う。これら3種の定量結果について比較検討を行い、そのDNAの分解指標などの評価を行った後、Globalfiler PCR Amplification Kitを用いて常染色体STR型検出を行う。さらに、昨年度のヒト特異的DNAの定量値および分解指数の値と比較検討し、関連学会などで発表する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験経過は順調に進んでいますが、昨年度の国内事情により、本研究の成果について、予定の学会で発表できなかった。また、本研究を行うにあたっての実験材料が当初予定していた価格が、キャンペーンなどにより安価で購入でき、残金が生じた。
(使用計画）繰越金と令和3年度の助成金を合わせて、本研究を行う際の実験材料（DNAを抽出するのに必要なキット、蛍光物質を用いて定量するQubit dsDNA HS Assay Kit、Qubit 1x dsDNA HS Assay KitおよびPCR阻害に強く、DNAの分解の程度も把握可能なTaqMan法を利用したQuantifiler Trio DNA Quantification Kitなど）の購入にあてたい。
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