| 研究課題/領域番号 |
20K10557
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
笹尾 亜子 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (80284751)
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| 研究分担者 |
山口 佳宏 熊本大学, 環境安全センター, 准教授 (10363524)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 法医中毒学 / 薬毒物スクリーニング / 免疫学的検出 / 向精神薬 / 非ベンゾジアゼピン系睡眠薬 / 抗体ファージライブラリー |
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| 研究実績の概要 |
法医解剖や検屍・検案時の死因診断において、その死因に薬物が関与したかを確認する事は極めて重要である。現在、その検査手段として免疫学的検出法を用いた簡易薬物検査キットが幅広く利用されている。免疫学的検出法は、簡便に対象薬物を検出できるため急を要する現場では最適なスクリーニング法である。
これまで我々は、新規薬物に対する免疫学的簡易検出法を組換え抗体技術を利用して提供する体制作りを行ってきた。特に、抗体検索に有用な抗体ファージライブラリーの構築は、迅速な薬物検出法の構築に大いに貢献できると考えている。そこで我々は、近年処方が拡大している非ベンゾジアゼピン系睡眠薬を標的とした抗体ファージライブラリーの構築とその検出法の開発を本研究課題の目的とした。
本年度は、非ベンゾジアゼピン系睡眠薬ザレプロンをターゲットとした抗体検索を行うための抗体ファージライブラリー構築を行った。まず、昨年度調製したザレプロン類似化合物とキャリアタンパク質との複合体（免疫抗原）をマウスに経時的に投与して血清中抗体活性の上昇を確認した（進捗1：マウスへの免疫と抗体活性確認）。次に抗体活性の高いマウスから脾臓を摘出し、脾細胞からRNA抽出を行った。mRNAから抗体遺伝子の増幅を行い、一本鎖抗体ライブラリーを作製した（進捗2：抗体ファージライブラリーの構築）。今後は、このライブラリーからザレプロンやその類似構造を持つ薬物に対する抗体が検索可能か、またどの程度の結合能を示すかを検討していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、上記概要に述べたように非ベンゾジアゼピン系睡眠薬ザレプロンに対する抗体ファージライブラリーの構築を以下の通りに実施した。
1）マウスへの免疫と抗体活性確認：雌性マウス5匹に対し、免疫抗原とアジュバントを混合して皮下に投与し、隔週で同投与を繰り返した。２回免疫後、尾部から少量採血を行って血清を採取した。免疫抗原とは異なるタンパク質に結合させたザレプロン複合体を固相化したELISAプレートを作製し、これを用いて抗体活性の有無を確認した。いずれのマウス血清においても、免疫後の抗体活性上昇が認められた。
2）抗体ファージライブラリーの構築：抗体活性の高いマウスから脾臓を摘出し、RNA抽出を行った。RT-PCRによりcDNAを合成、抗体遺伝子のプライマーミックスを用いて重鎖と軽鎖の可変領域（VH、VL）遺伝子の増幅を行った。アッセンブリPCRによりscFv遺伝子を作製し、ベクター（pCANTAB 5E）に挿入した。大腸菌（TG1）に形質転換して一本鎖抗体ファージライブラリーとして保存した。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、上記で作製した一本鎖抗体ファージライブラリーを用いて、ザレプロン類似構造に反応性のあるファージの選別を実施している。また、類似化合物についても同様の検討を行っていく。これらのパンニングによって結合能の高いファージを選別し、その抗体遺伝子の解析や組換え抗体の作製を行う。なお、検出法の構築については共同研究者の協力の下でより簡便な検出法を模索していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナによる影響から在宅勤務による研究活動の遅延がやや生じているため。また、培養用消耗品の欠品や購入予定の試薬等の納品遅延が起きているため、次年度以降に購入が持ち越しの状態となっている。消耗品については代替品の注文などで解消していく予定である。
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