2020 年度実施状況報告書

特発性TGCV発症におけるATGL遺伝子領域のエピゲノム変化の解析

研究課題

研究課題/領域番号	20K11555
研究機関	大阪大学
研究代表者	原康洋大阪大学, 医学系研究科, 特任研究員(常勤) (70568617)
研究分担者	平野賢一大阪大学, 医学系研究科, 特任教授(常勤) (30332737)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	TGCV / エピジェネティックス / ATGL
研究実績の概要	中性脂肪蓄積心筋血管症(TGCV)は、当研究室で発見された心筋と冠動脈へのトリグリセリド(TG)蓄積により重症心不全、冠動脈疾患を来す新規難病であり、TGリパーゼであるadipose triglyceride lipase(ATGL)が欠損している原発性とATGL遺伝子に変異がない特発性に分類される。特に特発性TGCVはATGL遺伝子に欠損が存在しないがATGL活性が著減することを特徴とし、その発症機構の解明が急務である。本研究では、その発症の分子機序を明らかにすることを目的とし、特発性TGCVにおいてATGL遺伝子が受けるエピジェネティックな抑制を調べることを当初の課題としていた。しかしながら、その後、特発性TGCVではATGLタンパク質量に変化がなく酵素活性レベルで負の調節を受けることがわかった。それにより当初の予定との変更を余儀なくされたが、特発性TGCVの発症には脂質代謝関連遺伝子のエピジェネティックな変化が重要な役割を果たしている可能性は高いとの推測に変わりはない。そこで令和2年度は特発性TGCVの発症に関わるエピジェネティック制御研究のための調査、予備検討を中心とした。TGCVの顕著な病巣である心筋の培養細胞を研究対象とし、心筋培養細胞を用いた既存の代謝研究の調査からラット心筋細胞H9C2を対象とし、特発性TGCVの多くが糖尿病に合併して見られることを考慮し、H9C2細胞に高グルコースあるいは高脂肪酸による負荷をかけ、肥大、TG蓄積、インスリン抵抗性といった障害を誘導し、エピジェネティック変化を調べるという新規な研究課題を構築した。現在までにH9C2細胞を用いた様々な状態での培養による障害誘導の検討を開始している。また、分子生物学的手法を用いた方法として、①CRISPR-Cas9によるH9C2細胞におけるATGL遺伝子のノックダウン、②H9C2細胞における脂肪酸トランスポーターCD36高発現株の作製をすでに行っている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由心筋と冠動脈へトリグリセリド(TG)が蓄積する中性脂肪蓄積心筋血管症(TGCV)のうち、TGリパーゼであるATGLに遺伝子欠損がない特発性TGCVにおいてはATGL発現が著減することが発症の主要な原因と考えられていた。そこで本研究課題の核心となる目的として「特発性TGCVにおけるATGL発現の著減が、ATGL遺伝子領域のエピゲノム変化を介した抑制によるものか否か」を設定した。しかしながら、その後の精密な検討により特発性TGCVにおけるATGL発現量は健常人と変化がなく、むしろ酵素活性レベルで強い抑制を受けていることが判明した。当初予測していなかった本事象により、特発性TGCV発症機構におけるエピゲノム変化の研究に関して新たな課題を設定することが必要となった。そこで令和2年度は新たな研究課題設定のための調査、予備検討を中心に行うこととなった。また、研究課題開始時において新型コロナウイルス蔓延防止のため緊急事態宣言が施行され、実験自粛、在宅勤務となり、課題進展に遅れを生じた。
今後の研究の推進方策	TGCVの顕著な病巣である心筋の培養細胞を研究対象とし、心筋培養細胞を用いた既存の代謝研究の調査からラット心筋細胞H9C2を対象とし、特発性TGCVの多くが糖尿病に合併して見られることを考慮し、H9C2細胞に高グルコースあるいは高脂肪酸による負荷をかけ、肥大、TG蓄積、インスリン抵抗性といった障害を誘導し、エピジェネティック変化を調べるという新規な研究課題を構築した。現在までにH9C2細胞を用いた様々な状態での培養による障害誘導の検討を開始している。また、分子生物学的手法を用いた方法として、①CRISPR-Cas9によるH9C2細胞におけるATGL遺伝子のノックダウン、②H9C2細胞における脂肪酸トランスポーターCD36高発現株の作製をすでに行っている。
次年度使用額が生じた理由	当初予測していなかった新事実判明により、特発性TGCV発症機構におけるエピゲノム変化の研究に関して新たな課題を設定することが必要となった。そのため令和2年度は新たな研究課題設定のための調査、予備検討を中心に行ったことによる。また、研究課題開始時において新型コロナウイルス蔓延防止のため緊急事態宣言が施行され、実験自粛、在宅勤務となり、課題進展に遅れを生じた。令和3年度は細胞を用いた研究遂行のための細胞培養用消耗品、エピゲノム解析に用いるゲノムDNA細断のための超音波ホモジナイザーの購入を計画している