| 研究課題/領域番号 |
20K11590
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
藤城 緑 日本大学, 医学部, 助教 (50420211)
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| 研究分担者 |
山名 碧 日本大学, 医学部, 助手 (40869468)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 2型糖尿病 / キサンチン酸化還元酵素 |
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| 研究実績の概要 |
糖尿病は、血糖値が高い状態が長期間持続することによって、さまざまな合併症を引き起こす病気です。日本人糖尿病の約9割は、生活習慣が原因で血糖値を下げるインスリンの作用が不足する2型糖尿病ですが、遺伝的にインスリンの分泌が少ないことも、影響しています。肥満の2型糖尿病患者では、酸化ストレスや慢性的な炎症が全身の血管合併症を進行させることが知られています。中でも、尿酸代謝に関わるキサンチン酸化還元酵素（XOR）の働きが強くなっていることが、最近注目されています。インスリンを作り出す膵臓のβ細胞や、インスリンの働きにより血糖値を取り込む脂肪細胞では、XORの活性が高いことが報告されていますが、現在まで、膵β細胞でのインスリン分泌機構や、脂肪細胞でのインスリン作用機序におけるXORの役割の詳細については解明されていません。本研究では、膵臓や脂肪の細胞に遺伝子操作を施して、インスリンの作用と分泌の両者の障害に、XORがどのように影響しているかを解き明かすことで、低血糖を誘発しにくい、抗糖尿病薬の創薬に繋がる成果を目指しています。
2020年度は、膵臓や脂肪の細胞に遺伝子操作を行うために、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)の作製準備を開始しました。具体的には、目的の遺伝子を含むプラスミド、AAVの発現調節因子および特定の重要なタンパクを発現するプラスミド、AAV産生に必要なアデノウイルスタンパクを発現するプラスミドの作成に着手しています。今後、これら3つのプラスミドをHEK293細胞に導入して、組換えAAVを作製していきます。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、2型糖尿病で見られるXOR亢進状態における、インスリン分泌およびインスリン作用の両側面における障害を基礎レベルで解明するために、インスリン分泌臓器を代表する膵β細胞と、インスリン作用臓器を代表する脂肪細胞の両者を遺伝子修飾することにより、それぞれの細胞における、XOR作用の重要性を明らかにすることを目的としている。XOR蛋白を過剰発現および発現抑制させるために、導入効率が良く、我々がこれまでの経験から手技を熟知しているアデノウイルスベクターを用いた手法の採用を計画した。2020年度は、まず、XOR cDNAとXOR shRNA配列（Kushiyama A, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012）をアデノウイルス作製シャトルベクターに組み込み、293細胞を用いてそれぞれを発現するアデノウイルスを作成した。予備実験として、マウス胎児線維芽細胞株3T3-L1細胞を成熟脂肪細胞に分化させ、インスリン刺激により、グルコース取り込みが亢進することを確認した。正常に分化していることが確認できた3T3-L1細胞にアデノウイルスを感染させ、一過性に遺伝子修飾タンパクを過剰発現させる手法を試みたが、残念ながら感染効率が悪く、期待する遺伝子修飾効果を確認できなかった。そのため、より安全で、非分裂細胞において長期間の発現が可能なアデノ随伴ウイルス（Adeno-Associated Virus：AAV）を用いて、安定的な遺伝子導入操作を行う手法に切り替えることとした。これにより、組み換えAAVの作製から再始動することが必要となり、当初予定より、計画が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
脂肪細胞と膵β細胞におけるXOR作用の重要性を明らかにする目的で、XOR蛋白を過剰発現および発現抑制させるために、当初予定していたアデノウイルスによる手法ではなく、より安全で、非分裂細胞において長期間の発現が可能なアデノ随伴ウイルス（AAV）を用いて、安定的な遺伝子導入操作を行うこととした。まず、XOR遺伝子を含むplasmid、AAVの発現調節因子およびcapsidタンパクを発現するplasmid、AAV産生に必要なadenovirusタンパクを発現するplasmidを大腸菌で構築し、増殖させる。次に、これら3つのplasmidをHEK293細胞に導入し、組換えAAVを作製する。成熟脂肪細胞に分化させた3T3-L1細胞に、AAV遺伝子導入システムによりXOR遺伝子を過剰発現または発現抑制させ、細胞アポトーシスの程度、ブドウ糖取り込み能を検証する。次に、膵β細胞由来細胞株MIN6細胞に、同様の手法でXOR遺伝子を過剰発現または発現抑制させ、細胞アポトーシスの程度、細胞内インスリン量、グルコース応答性のインスリン分泌能を検証する。そして、これら遺伝子発現修飾細胞におけるtranscriptome、proteome、metabolomeを検討し、omicsアプローチにより、その分子メカニズムを解明する。
さらに、XOR遺伝子を発現修飾させた3T3-L1細胞およびMIN6細胞の両者において、3種のMAPK経路蛋白活性の変化や、mTOR経路蛋白およびインスリンシグナル伝達経路蛋白の変化について詳細に検討し、MAPK・mTOR・インスリンシグナル伝達経路へのXORの関与を明らかにする。
細胞レベルでのXOR作用の重要性を確認できた後は、脂肪細胞または膵β細胞特異的にXOR蛋白を発現修飾させたマウスを作成し、個体レベルでの、脂肪細胞および膵β細胞におけるXOR作用の重要性を明らかにする。
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