| 研究課題/領域番号 |
20K11658
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
小谷 侑 藤田医科大学, 医学部, 講師 (60644622)
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| 研究分担者 |
金子 葉子 岐阜医療科学大学, 薬学部, 教授 (20319263)
長崎 弘 藤田医科大学, 医学部, 教授 (30420384)
河田 美穂 藤田医科大学, 医学部, 助教 (90761601)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 視床下部 / 神経幹細胞 / タニサイト / ES細胞 / 分化誘導 |
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| 研究実績の概要 |
成体視床下部に存在する神経幹細胞は、新たな視床下部ニューロンの産生やエクソソーム（細胞外小胞）の分泌を介して、抗肥満・抗老化作用を発揮すると考えられている。本研究では、成体視床下部幹細胞の実体とされるタニサイト（第三脳室の上衣細胞）に焦点を当て、本細胞の維持や機能調節に関わるニッチシグナル（環境シグナル）の解明を目的とする。
2020年度は、マウス胚性幹細胞（ES細胞）を用いたタニサイトの分化誘導系において、種々の発生マーカーの発現と細胞形態の変化を経時的に解析し、タニサイト発生過程の詳細な特徴づけを行った。胎生期～成体における視床下部幹細胞系譜ではRaxと呼ばれる転写因子を恒常的に発現しているため、Rax遺伝子座にGFP遺伝子を挿入したマウスES細胞株を用いて分化誘導を行い、Rax::GFP陽性細胞（すなわち視床下部幹細胞系譜）の経時的変化を解析した。その結果、Rax::GFP陽性細胞は、神経上皮細胞→放射状グリア→タニサイトの順に生体内と同様の段階的な発生過程を辿ることが分かった。またこれらの解析の結果から、各発生段階の幹細胞（神経上皮細胞、放射状グリア、タニサイト）を個別に単離するための最適な分化タイミングと、単離の指標となる細胞表面マーカーを決定した。以上のデータに基づき、次年度はES細胞から誘導した各発生段階の幹細胞を単離してRNAシーケンシング（RNA-seq）による網羅的な遺伝子発現解析を行い、タニサイトの維持や機能制御に関わるシグナル伝達経路を検討する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初計画では、2020年度中にマウスES細胞と分化誘導したタニサイトの遺伝子発現解析を行い、両者を比較する予定であった。しかしながら、最近のRNA-seqを用いた視床下部発生の研究報告から、タニサイトの機能的特徴と遺伝子発現パターンの相関をより詳細に検討するためには、分化途上の細胞（神経上皮細胞や放射状グリア）についても遺伝子発現解析を行い、タニサイトと比較する必要があると考えられた。このため、2020年度はこれらの分化途上の細胞を単離する条件の検討に時間を要した。COVID-19の影響により本研究課題への着手が遅れたこともあり、遺伝子発現解析は次年度に持ち越すこととなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
2020年度の成果に基づき、マウスES細胞から分化誘導した視床下部幹細胞系譜（神経上皮細胞、放射状グリア、タニサイト）をそれぞれ単離し、遺伝子発現パターンの比較を行う。具体的には、各細胞集団に最適な分化日数において、Rax::GFPおよび細胞表面マーカーの発現を指標にしてセルソーティングを行い、バルクRNA-seqを実施する。得られたデータから細胞分化に伴う遺伝子発現の連続的な変化を解析し、タニサイトの機能制御に関わるシグナル伝達経路を推定する。次に、ES細胞由来のタニサイトまたは生体より単離したタニサイトを対象として、上記のシグナル伝達経路を薬理学的または遺伝学的に操作し、幹細胞機能（増殖・分化）やエクソソーム分泌能がどのような影響を受けるかを評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
「現在までの進捗状況」に記載したように、当初計画には無かった実験を追加したことと、COVID-19の影響により研究への着手が遅れたことから、2020年度に実施する予定であった実験（遺伝子発現解析や初代培養実験など）を次年度に持ち越した。よってこれらの実験に必要な物品費が次年度使用額として生じた。次年度に新たに請求した助成金については、当初の実験計画に従い使用する。具体的には、遺伝子発現解析の結果からタニサイトの機能制御に関わるニッチシグナルを推定し、ES細胞由来または初代培養タニサイトを用いて、当該シグナル因子が幹細胞機能やエクソソーム分泌能へ及ぼす影響の評価実験を行う。
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