| 研究課題/領域番号 |
20K11658
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
小谷 侑 藤田医科大学, 医学部, 講師 (60644622)
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| 研究分担者 |
金子 葉子 岐阜医療科学大学, 薬学部, 教授 (20319263)
長崎 弘 藤田医科大学, 医学部, 教授 (30420384)
河田 美穂 藤田医科大学, 医学部, 助教 (90761601)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 視床下部 / 神経幹細胞 / タニサイト / ES細胞 / オルガノイド |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までの研究成果により、マウス胚性幹細胞（ES細胞）からタニサイトを含む視床下部様組織（オルガノイド）を分化誘導して培養下で長期間維持する方法を確立した。またこの培養系において、視床下部幹細胞特異的な転写因子であるRaxがタニサイトの幹細胞性の維持に寄与している可能性を見出した。2022年度は、上記オルガノイド内のタニサイトにおけるRaxの発現動態を検討した。Rax遺伝子の一方が緑色蛍光蛋白質（GFP）遺伝子で置換されたヘテロノックインES細胞株（Rax::GFP株）を用いて、内在性のRaxタンパク質とGFPの発現を免疫組織化学的に検討したところ、Raxを発現しないGFP陽性細胞が一部観察され、これらはGFPの発現も弱い傾向が見られた。これらのRax陰性かつGFP弱陽性細胞は、幹細胞性を失い神経細胞等へと分化しつつあるタニサイトであることが示唆された。次に、生体内においてタニサイトの増殖や神経分化を調節することが示唆されているソニックヘッジホッグ（Shh）シグナルに着目した。高濃度のShhシグナル活性化剤を添加してオルガノイドの長期培養を行ったところ、タニサイトの割合が増加するとともに、Rax::GFPの発現が上昇することを見出した。以上の結果より、ShhシグナルはRaxの発現を介してタニサイトの維持に寄与している可能性が示唆された。また、Shhシグナルにより分化が促進される視床下部ペプチド神経について、培養上清中へのペプチド分泌量を測定したところ、タニサイトの発生とともに分泌量の増加が観察されたことから、タニサイトの調節因子として働く可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
2022年度はタニサイトを蛍光標識するための新たなマウスES細胞株として、Rax遺伝子の下流にIRESまたはT2A配列を介してGFP遺伝子をノックインしたES細胞株の作製を計画していた。しかしこの方法では、本来のRaxの発現制御や機能に影響を及ぼす可能性が考えられた。最近の研究から、GFP等の外来遺伝子を一過性に発現させるためのRaxプロモーター配列が同定されたため、この配列を導入してタニサイトを蛍光標識する方がRaxの生理的な機能を評価するうえで適当であると考えた。そこで当初の計画を変更し、Raxプロモーター配列のクローニングと高輝度改変型GFPであるmGreenLantern（mGL）を導入したプラスミドベクターの準備を現在進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
正常なRaxの発現を維持したうえでオルガノイド内のタニサイトを蛍光標識するために、Raxプロモーター制御下でmGLを発現するプラスミドベクターを作製する。これを未分化マウスES細胞に導入することで安定発現株を樹立する予定である。ゲノムへのランダムな挿入を防止するため、Rosa26遺伝子座へのノックインベクターを活用し、Rax-mGL発現カセットをRosa26遺伝子座に挿入することを計画している。得られたES細胞株から視床下部オルガノイドを作製し、Shhや視床下部ペプチドを始めとするニッチ候補因子が、Raxの発現とタニサイトの機能制御に及ぼす影響を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
「現在までの進捗状況」に記載したように、研究計画を一部変更したため遅延が生じ、 2022年度に実施する予定であった実験（タニサイトの機能制御に関わるニッチシグナル因子の探索および機能評価実験）の一部を次年度に持ち越した。よってこれらの実験に必要な消耗品類の物品費が次年度使用額として生じた。
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