| 研究課題/領域番号 |
20K12170
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| 研究機関 | 金沢医科大学 |
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研究代表者 |
松井 理 金沢医科大学, 医学部, 助教 (60288272)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Plectin / 53BP1 / p53 |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者はこれまでにPlectinと53BP1が細胞内で結合していることを見出したが、この結合は放射線照射の有無に関わらず認められる。一方、53BP1は放射線照射によりDNA二本鎖切断（DSB）部位に集積することが知られているが、PlectinのDSB部位への集積はこれまでに何度か観察を試みたが確認できていない。以上から研究代表者は、Plectinが結合している53BP1はDSB部位へ集積せず、これまでに知られているものとは全く機能や種類の異なる53BP1複合体なのではないかと予想した。そこで、このことを解明する糸口を得るために、まず53BP1の Plectinとの結合領域を調べることにした。53BP1の機能に関わる領域として、p53との結合に必要な領域、DSB部位集積に必要な領域、DSB修復の制御に必要な領域などが既に知られており、これらの領域を様々な組合せで欠失させた53BP1発現ベクターを作製した。これらをヒト培養細胞株に導入しPlectinとの結合領域を調べようとしたところ、53BP1には細胞内で自分自身が複数個集まってオリゴマーを形成する性質があるため、これらの発現ベクターから産生された組換え蛋白質のうち、いくつかは元々細胞にあった内在性の53BP1と結合し複合体を形成してしまうことが明らかになった。内在性53BP1は完全な状態なので、これが複合体中に存在する場合、Plectinが組換え蛋白質と結合しているのか、あるいは内在性53BP1と結合しているのかを区別することができない。そこで、この問題を解決するために、CRISPR/Cas9を用いて内在性53BP1を欠失させた細胞（53BP1ノックアウト細胞）の作製を試みたが、これまでに53BP1を完全に欠失した細胞は得られていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
Plectinと53BP1との結合領域を決定するため、53BP1の様々な領域を欠失させた組換え蛋白質の発現ベクターを作製し、これをヒト培養細胞に導入して結合領域の同定を試みたが、通常の細胞では完全な状態の内在性53BP1が存在し、いくつかの組換え蛋白質は、前述のようにこれと結合してしまうため、結合領域の同定に至っていない。この問題を解決するため、新たに内在性53BP1を欠失させた53BP1ノックアウト細胞の作製を試みているが、現在まで細胞は得られておらず、このため研究計画に遅延が生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
内在性53BP1をノックアウトするためにこれまで2種類の異なるcrRNAを用いてきたが、さらに新たなcrRNAを追加し、ノックアウト細胞作製を継続する。また、内在性53BP1の欠失させるための別の方法として、siRNAによるノックダウンも同時進行で行う。内在性53BP1をノックダウン可能なsiRNAはすでに有しているが、この場合、いくつかの発現ベクターにはsiRNAの標的配列が含まれるため、この配列を改変することによりsiRNAとの同時使用を可能にする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進行に遅延が生じ、遅れた分の研究計画に伴う経費を次年度に持ち越ししたため。持ち越した経費については未達分の研究計画の遂行に使用する。
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