| 研究課題/領域番号 |
20K12174
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| 研究機関 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 |
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研究代表者 |
坂本 綾子 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 放射線生物応用研究部, 上席研究員 (00354960)
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| 研究分担者 |
横田 裕一郎 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 放射線生物応用研究部, 主幹研究員 (30391288) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ヒメツリガネゴケ / 相同組換え / DNA二重鎖切断 / ガンマ線 / 放射線応答 |
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| 研究実績の概要 |
DNAポリメラーゼζ (Polζ)を欠損したシロイヌナズナの変異体 (rev3-1)は放射線に対して感受性を示すことから、植物のPolζがDNA二重鎖切断修復に関与していることが示唆されているが、その証拠は得られていない。本研究ではシロイヌナズナおよびヒメツリガネゴケを材料に用いてPolζの新規機能の探索を行うことを目的としている。R3年度は、マーカー遺伝子を利用した突然変異検出系の構築とシロイヌナズナ根端メリステムにおける細胞死の検出、及びPolζ遺伝子の発現調節に関わる解析を行った。
1) DNA二重鎖切断修復プロセスに由来する突然変異をモニターするため、ヒメツリガネゴケ原糸体組織に対してガンマ線照射を行うことで突然変異を誘発した。この細胞集団を2-フルオロアデニン(2-FA)を含む培地上でスクリーニングすることにより、アデニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ (APT) 遺伝子が機能欠損を起こした突然変異細胞を単離し、APT遺伝子領域のシークエンスによって生じた突然変異を特定した。
2) DNA損傷時に生じる根端メリステム組織の細胞死の誘導においてPolζが機能しているかどうか調べるため、野生型シロイヌナズナ及びPolζ機能欠損変異体(rev3-1)に対して放射線を照射し、根端をヨウ化プロピジウム(PI)で染色した結果、放射線処理を行った幼植物の根端メリステムにおいて細胞死を検出した。
3) 高等植物の放射線応答反応で中心的な役割を果たす転写因子SOG1とPolζとの関係を調べるため、シロイヌナズナsog1-1、rev3-1、及び両者の二重変異体に対してUVBを照射し、根の伸長を計測した。その結果、sog1-1ではUVB照射後も根の伸長が継続するのに対し、rev3-1とsog1-1 rev3-1では根の伸長が停止したことから、PolζがSOG1よりも上位に位置することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、APT遺伝子配列を利用した相同組換え実験系およびPolζ欠損株の構築を予定していたが、これらの作業を共同で行う予定だった研究分担者が急死したため、実験系の構築を予定通り進めることができなかった。一方、ヒメツリガネゴケSOG1欠損株を用いた解析から、Polζの機能に関する新たな知見を得ることができた。
1) R2年度に作製を試みた相同組換えマーカーとPolζ欠損株はそれぞれに問題があり、実験に用いるに十分な条件を満たしていなかった。そこで、R3年度に再構築を試みたが、プロトプラストの調製と遺伝子導入の効率が安定せず、目的の株を得ることができなかった。
2) 高等植物の放射線応答反応で中心的な役割を果たす転写因子SOG1とPolζとの関連性を調べるため、ヒメツリガネゴケSOG1欠損株におけるPolζ遺伝子(PpREV3)の発現を解析した。その結果、SOG1欠損株ではPpREV3の発現が減少していることから、PpREV3がSOG1によって制御されている可能性が示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
R4年度は、共同研究者のノートを参考に相同組換え実験系およびPolζ欠損株の再調整を試みる。また、シロイヌナズナREV3欠損株を利用してDNA損傷応答経路の解明に取り組む。
1) ヒメツリガネゴケ原糸体組織よりプロトプラストを調整し、これにsgRNA、Cas9遺伝子、および薬剤耐性遺伝子を発現するプラスミドを導入することで、PpREV3、およびPpRNaseH2のゲノム領域に欠損を持つ細胞をスクリーニングする。
2) アデニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ (APT) 遺伝子を突然変異マーカーとして利用し、紫外線やガンマ線、ブレオマイシン処理などによって生じる突然変異スペクトルを解析する。
3 ヒメツリガネゴケ原糸体組織または茎葉体組織にガンマ線またはイオンビームを照射し、組織の再生効率や細胞死の様子を観察する。また、ゲノムDNAを抽出しリボヌクレオチドの取り込み状況を解析する。
4) シロイヌナズナ変異体に対してガンマ線やイオンビームを照射し、根端組織での細胞死やDNA複製活性を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、APT遺伝子配列を利用した相同組換え実験を予定していたが、実験系の構築を担当する予定だった研究分担者が急死したため、これらの解析に使用する予定だった消耗品費などが未使用となった。また、新型コロナウイルス感染拡大のために国際会議・国内会議がオンライン開催となり、学会参加のための旅費が未使用となった。R4年度は新たに計画に加えたシロイヌナズナ変異系統を用いた解析に必要な消耗品を購入することで、研究の遅れを取り戻す予定である。
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