| 研究課題/領域番号 |
20K12179
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| 研究機関 | 公益財団法人放射線影響研究所 |
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研究代表者 |
野田 朝男 公益財団法人放射線影響研究所, 分子生物科学部, 部長 (40294227)
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| 研究分担者 |
濱崎 幹也 公益財団法人放射線影響研究所, 分子生物科学部, 研究員 (80443597)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 放射線 / 遺伝影響 / 精原細胞 / 遺伝子編集 |
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| 研究実績の概要 |
放射線被ばくはゲノムに傷を付け、これが原因となり次世代に遺伝する突然変異が生じると考えられている。事実、培養可能なヒト細胞や実験動物の細胞（体細胞）を放射線照射し、生き残った細胞クローンを調べると、照射線量に比例した遺伝子突然変異頻度の増加が観察される。ゲノムレベルの解析では、放射線のゲノムへの影響は大規模な欠失や付加、あるいは染色体転座、逆位などが特徴とされる。では、個体レベルではどうか？父親あるいは母親被ばくの影響は培養体細胞とおなじ特徴を持って子供(被ばく二世)に継承されるのだろうか？この問題は原爆被爆二世やチェルノブイル被ばく二世の例でも未だ明らかでない。本研究では、モデル実験としてマウス生殖細胞の放射線誘発突然変異を調べ、さらに大規模な欠失や付加、あるいは染色体転座、逆位を人工的に作成して、それらの次世代への遺伝性を検証するものである。初年度は培養可能なマウス精原幹細胞 (mouse germline stem cells: GS細胞)を用いて、放射線被ばくにより生じる突然変異の構造解析と、GS細胞を用いた遺伝子編集による大規模染色体構造変異の人工的な作成を試みた。被ばくGS細胞クローンの全ゲノム解析（シーケンス）を行った結果、放射線被ばくに特徴的な変異を検出する事に成功した。GS細胞のゲノム編集については、小規模な突然変異を染色体の特定位置に導入することはできたが、大規模欠失の作成には至らなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マウス精原幹細胞 （GS細胞）のin vitro培養系を用いて、放射線照射により生じる生殖細胞突然変異のシーケンス解析と、放射線突然変異を模倣する人工的な染色体構造突然変異の作成を開始した。本年度はGS細胞親クローンに４GyのX線を照射した後に生き残った被ばくクローンについて、突然変異をアレイCGHと全ゲノムシーケンスにより網羅的に検出する事を試みた。その結果として、アレイCGHにて被ばく群に一例、欠失変異が検出された。この場合の染色体DNA切断面の両端にはホモロジーが無かったことから、DSBのNHEJによる修復が突然変異の成立に関与したことが推察された。。Short-reaｄ法による全ゲノムシーケンスでは、非被ばく部群（5クローン）と比較して被ばく群(5クローン)のSNVは若干の増加傾向を示した。一方、small Indelやmultisite mutationは明らかに有意な増加が見られた。1塩基から50塩基の範囲内での欠失(deletion)についての詳細な解析からは、非被ばくコントロール群とは異なり、被ばく群ではユニークなシーケンス部分の欠失が増加していることが明らかとなった。逆に、非被ばく群で見られたこれら小規模の欠失は、ほとんどの場合で繰り返し配列の短縮であった。これは、小規模の欠失型突然変異については、自然に起こるのは繰り返し配列部分に由来するのに対し、放射線ではユニークな配列部分で起こることを示唆していた。遺伝子編集術を応用した大規模欠失作成の試みについては、マウス個体レベルで親の被ばくにより仔マウスに生じたとの報告がある染色体欠失領域（6番染色体内の13Mb）を用いることとし、この中にCRISPR/Cas9 systemでDSBを2か所導入することを試みた。しかし、これまでのところ、2か所切断による欠失変異は未だ得られていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウス精原幹細胞の突然変異については全ゲノムレベルでの解析結果をまとめることが期待できる。これにより、精原細胞突然変異の特徴を明らかとする。但し、大規模な構造変異は頻度が低く、現時点でも1個しか確認できていない。過去の報告でも、親マウス４Gy照射により仔マウス100匹に1匹の割合でしか検出されていないことから、放射線被ばくに特徴的な染色体異常の次世代への伝達は相当に効率が悪いと考えられる。つまり、多くの構造変異は次世代へは生き残れないと思われる。この仕組みを解明するためには、人工的に作成した染色体構造変異をもつGS細胞の雄マウスへの移植と、精子形成、受精過程の観察が必要である。これにより、ゲノム異常を持つ生殖細胞を排除する仕組みを明らかとすることが本研究の最終目標である。CRISPR/Cas9による複数のDSB導入と染色体の大規模欠失を実現するには、切断点どうしの誤った再結合が必要である。今後はDSB repair inhibitor の併用により人工染色体欠失を実現することを試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
PCR酵素を購入する予定であったが5千円ほど足りなかったので、次年度物品費と合わせて購入する事とした。
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