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2021 年度 実施状況報告書

DNAポリメラーゼζ(ゼータ)が関与する内在的DNA構造と変異誘発の分子機構

研究課題

研究課題/領域番号 20K12181
研究機関広島大学

研究代表者

鈴木 哲矢  広島大学, 医系科学研究科(薬), 助教 (20573950)

研究期間 (年度) 2020-04-01 – 2023-03-31
キーワードDNA損傷 / 非B型DNA / 変異 / 損傷乗り越えDNA合成 / DNAポリメラーゼ ζ
研究実績の概要

変異検出用レポーター遺伝子であるsupF遺伝子の近傍に高次構造を取るDNA配列 (Z型DNA、3重鎖DNA) を導入したプラスミドを野生型細胞とPolζ変異型細胞 (低正確性型:L2618M、低活性型:D2781N) にそれぞれ導入し、変異スペクトル解析を行った。コントロールを含む全てのプラスミドにおいてAPOBEC3が関与すると考えられる変異 (TpC/GpA配列中のC/Gでの変異) が多数検出された。3重鎖DNAを有するプラスミドでは、他のプラスミドと比較してsupF遺伝子のセンス鎖におけるCでの変異が増加し、クラスター変異が多く見られた。これらの変異は、低活性型Polζ発現細胞で減少する傾向があった。また、Z型DNAを有するプラスミドでは、野生型や低正確性型Polζ発現細胞では、G:C→A:T、G:C→T:Aの割合が多かったが、低活性型Polζ発現細胞ではG:C→C:G変異の割合が多かった。さらに、非B型構造 (Z型DNA、3重鎖DNA、G4重鎖DNA) を取るDNA配列をTK1遺伝子のエキソン6の近傍に導入した野生型細胞を作製し、変異体頻度を測定した結果、いずれの細胞もコントロールと同程度の変異体頻度を示した。
また、前年度に作製したCre recombinase発現細胞に、RMCE (Recombinase-Mediated Cassette Exchange) 法のアクセプターとなる配列をTK1遺伝子のエキソン5と置換するようにノックインした細胞を作製した。さらに、TK1遺伝子のエキソン5を含むドナープラスミドを導入し、RMCEの効率を測定した結果、その効率は、約0.1%と低かったものの、ほぼ全ての細胞においてTK1遺伝子の機能が回復していた。さらに、RMCEの効率を上げるため、Cre recombinaseを蛋白質として導入する方法を試みるため、Cre recombinaseの大腸菌での発現および精製を行った。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

前年度に引き続き、変異誘発における非B型DNAの影響について解析を行った。変異誘発における非B型DNAの影響について、シャトルプラスミドを用いた実験から、非B型構造、特に3重鎖DNAがAPOBEC3を介した変異誘発に影響する可能性が示唆され、Polζが、これらの変異誘発に関与している可能性を示唆する結果が得られた。また、変異のレポーター遺伝子であるゲノム中のTK1遺伝子のエキソン近傍のイントロン領域に非B型構造を取るDNA配列を導入した細胞を作製し、野生型細胞での変異頻度を調べた。さらに、RMCEを利用したゲノムDNAでの損傷塩基による変異解析用の細胞およびドナー用のベクターを作製し、それに用いるCre recombinase蛋白質の発現および精製条件を決定できたことからおおむね順調に進捗していると判断した。

今後の研究の推進方策

ゲノム中に非B型構造を取るDNA配列を導入した細胞からPol ζの変異型細胞 (低正確性型:L2618M、低活性型:D2781N) を作製し、ゲノムでの非B型DNA構造の複製におけるPolζの役割について検討するとともに、DNA損傷である7,8-dihydro-8-oxoguanineや脱塩基部位あるいはリボヌクレオチドを部位特異的に含むオリゴDNAを用いて、supF遺伝子にこれらを導入したシャトルプラスミドを作製し、これらのプラスミドを野生型細胞とPolζ変異型細胞にそれぞれ導入し、誘発される変異の解析を行いDNA損傷のDNA合成におけるPolζの関与とその役割を検討する。また、Cre recombinaseによるRMCEを利用したゲノム中におけるDNA損傷により誘発される変異への影響についても解析を行う。

  • 研究成果

    (11件)

すべて 2022 2021

すべて 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 1件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Paradoxical role of the major DNA repair protein, OGG1, in action-at-a-distance mutation induction by 8-oxo-7,8-dihydroguanine2022

    • 著者名/発表者名
      Tetsuya Suzuki, Yudai Zaima, Toshihiro Fujikawa, Ruriko Fukushima, Hiroyuki Kamiya
    • 雑誌名

      DNA Repair

      巻: 111 ページ: 103276

    • DOI

      10.1016/j.dnarep.2022.103276

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Action-at-a-distance mutations at 5'-GpA-3' sites induced by oxidized guanine in WRN-knockdown cells2021

    • 著者名/発表者名
      Tetsuya Suzuki, Hiroshi Masuda, Madoka Mori, Rikako Ito, Hiroyuki Kamiya
    • 雑誌名

      Mutagenesis

      巻: 36 ページ: 349-357

    • DOI

      10.1093/mutage/geab027

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Similar frequency and signature of untargeted substitutions induced by abasic site analog under reduced human APE1 conditions2021

    • 著者名/発表者名
      Tetsuya Suzuki, Yuri Katayama, Yasuo Komatsu, Hiroyuki Kamiya
    • 雑誌名

      Journal of Toxicological Sciences

      巻: 46 ページ: 283-288

    • DOI

      10.2131/jts.46.283

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Error-prone bypass patch by a low-fidelity variant of DNA polymerase ζ in human cells2021

    • 著者名/発表者名
      Tetsuya Suzuki, Akira Sassa, Petr Gruz, Ramesh C Gupta, Francis Johnson, Noritaka Adachi, Takehiko Nohmi
    • 雑誌名

      DNA Repair

      巻: 100 ページ: 103052

    • DOI

      10.1016/j.dnarep.2021.103052

    • 査読あり / 国際共著
  • [学会発表] 遺伝子改変細胞を用いたDNA損傷による変異誘発とその制御機構の解明2021

    • 著者名/発表者名
      鈴木 哲矢
    • 学会等名
      第48回日本毒性学会学術年会
    • 招待講演
  • [学会発表] Effects of OGG1-knockdown on untargeted substitutions and large deletions induced by 8-hydroxyguanine2021

    • 著者名/発表者名
      Hiroyuki Kamiya, Tetsuya Suzuki
    • 学会等名
      第80回日本癌学会学術総会
  • [学会発表] 7,8-dihydro-8-oxoguanineによる遠隔作用変異誘発の方向性2021

    • 著者名/発表者名
      鈴木哲矢、福島瑠里子、紙谷浩之
    • 学会等名
      第60回日本薬学会中国四国支部学術大会
  • [学会発表] 8-Oxo-7,8-dihydroguanineによる遠隔作用変異誘発におけるCpGメチル化の影響2021

    • 著者名/発表者名
      鈴木 哲矢、紙谷 浩之
    • 学会等名
      日本環境変異原ゲノム学会第50回記念大会
  • [学会発表] 8-Oxo-7,8-dihydroguanineにより誘発される遠隔作用変異へのAPOBEC3シトシンデアミナーゼの関与2021

    • 著者名/発表者名
      福島瑠里子、鈴木 哲矢、紙谷 浩之
    • 学会等名
      日本環境変異原ゲノム学会第50回記念大会
  • [学会発表] DNA中に取り込まれたriboguanosineによる遠隔作用変異の解析2021

    • 著者名/発表者名
      安井 聖晴、鈴木 哲矢、紙谷 浩之
    • 学会等名
      日本環境変異原ゲノム学会第50回記念大会
  • [学会発表] 8-Oxo-7,8-dihydroguanineを起点とした遠隔作用変異誘発におけるAPOBEC3の関与2021

    • 著者名/発表者名
      鈴木哲矢、福島瑠里子、紙谷浩之
    • 学会等名
      日本薬学会第142年会

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公開日: 2022-12-28  

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