| 研究課題/領域番号 |
20K12181
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
鈴木 哲矢 広島大学, 医系科学研究科(薬), 助教 (20573950)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | DNA損傷 / 非B型DNA / 変異 / 損傷乗り越えDNA合成 / DNAポリメラーゼ ζ |
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| 研究実績の概要 |
変異検出用レポーター遺伝子であるsupF遺伝子の近傍に高次構造を取るDNA配列 (Z型DNA、3重鎖DNA) を導入したプラスミドを野生型細胞とPolζ変異型細胞 (低正確性型：L2618M、低活性型：D2781N) にそれぞれ導入し、変異スペクトル解析を行った。コントロールを含む全てのプラスミドにおいてAPOBEC3が関与すると考えられる変異 (TpC/GpA配列中のC/Gでの変異) が多数検出された。3重鎖DNAを有するプラスミドでは、他のプラスミドと比較してsupF遺伝子のセンス鎖におけるCでの変異が増加し、クラスター変異が多く見られた。これらの変異は、低活性型Polζ発現細胞で減少する傾向があった。また、Z型DNAを有するプラスミドでは、野生型や低正確性型Polζ発現細胞では、G:C→A:T、G:C→T:Aの割合が多かったが、低活性型Polζ発現細胞ではG:C→C:G変異の割合が多かった。さらに、非B型構造 (Z型DNA、3重鎖DNA、G4重鎖DNA) を取るDNA配列をTK1遺伝子のエキソン6の近傍に導入した野生型細胞を作製し、変異体頻度を測定した結果、いずれの細胞もコントロールと同程度の変異体頻度を示した。
また、前年度に作製したCre recombinase発現細胞に、RMCE (Recombinase-Mediated Cassette Exchange) 法のアクセプターとなる配列をTK1遺伝子のエキソン5と置換するようにノックインした細胞を作製した。さらに、TK1遺伝子のエキソン5を含むドナープラスミドを導入し、RMCEの効率を測定した結果、その効率は、約0.1%と低かったものの、ほぼ全ての細胞においてTK1遺伝子の機能が回復していた。さらに、RMCEの効率を上げるため、Cre recombinaseを蛋白質として導入する方法を試みるため、Cre recombinaseの大腸菌での発現および精製を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度に引き続き、変異誘発における非B型DNAの影響について解析を行った。変異誘発における非B型DNAの影響について、シャトルプラスミドを用いた実験から、非B型構造、特に3重鎖DNAがAPOBEC3を介した変異誘発に影響する可能性が示唆され、Polζが、これらの変異誘発に関与している可能性を示唆する結果が得られた。また、変異のレポーター遺伝子であるゲノム中のTK1遺伝子のエキソン近傍のイントロン領域に非B型構造を取るDNA配列を導入した細胞を作製し、野生型細胞での変異頻度を調べた。さらに、RMCEを利用したゲノムDNAでの損傷塩基による変異解析用の細胞およびドナー用のベクターを作製し、それに用いるCre recombinase蛋白質の発現および精製条件を決定できたことからおおむね順調に進捗していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ゲノム中に非B型構造を取るDNA配列を導入した細胞からPol ζの変異型細胞 (低正確性型：L2618M、低活性型：D2781N) を作製し、ゲノムでの非B型DNA構造の複製におけるPolζの役割について検討するとともに、DNA損傷である7,8-dihydro-8-oxoguanineや脱塩基部位あるいはリボヌクレオチドを部位特異的に含むオリゴDNAを用いて、supF遺伝子にこれらを導入したシャトルプラスミドを作製し、これらのプラスミドを野生型細胞とPolζ変異型細胞にそれぞれ導入し、誘発される変異の解析を行いDNA損傷のDNA合成におけるPolζの関与とその役割を検討する。また、Cre recombinaseによるRMCEを利用したゲノム中におけるDNA損傷により誘発される変異への影響についても解析を行う。
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