| 研究課題/領域番号 |
20K12232
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| 研究機関 | 秋田大学 |
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研究代表者 |
後藤 猛 秋田大学, 本部, 理事 (10215494)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | シリカ生成ペプチド / 分子インプリント / シリカテイン / レアメタル / 白金族金属 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は，自然界の仕組みを模倣・活用し，標的とする金属をペプチドとシリカで分子インプリントした選択的金属吸着担体を開発することを目的とするものである。2020年度の研究において，海産珪藻シリカの結晶生成と成長を誘起するペプチド（R5）にHisタグを付加したR5His6をコードするプラスミドを構築し形質転換した大腸菌をIPTGとTEOS/HCl混合溶液の存在下で培養したが，シリカ固形物の生成が認められたものの，明確なペプチド生成は確認されなかった。これは，R5His6 が短鎖ペプチド（6.7 kDa）であるため大腸菌内でプロテアーゼ分解を受け易い可能性が考えられた。そこで，2021年度において，R5His6を3ユニット連結した3(R5His6)のcDNAを有する発現プラスミドを調製し，組換え大腸菌を構築した。しかしながら，遺伝子の導入自体が不安定であり，3(R5His6)ペプチドは大腸菌に対して強い細胞毒性を示すことが示唆された。そこで，分泌発現可能な Brevibacillus の組換え体（B.Choshinensis-pBIC3-BCR5His6）を構築し，BCR5His6 ペプチドの分泌生産を試みたところ，菌体外に加えて菌体内においても大量のBCR5His6 ペプチドの蓄積が確認された。
一方，シリカ生成を触媒する酵素シリカテインαについては，2020年度に組換え大腸菌を構築し培養したところ，シリカテインαは菌体内に大量発現したが，その多くは水不溶の封入体となっていた。そこで2021年度においては，透析法によるリフォールディングを試み，条件検討の結果，高収率で可溶化させることに成功した。さらに，可溶化シリカテインαはTEOSを基質としてシリカ結晶生成活性を有していることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
目的のR5His6ペプチドの高い塩基性に起因する細胞毒性により，当初予定の組換え大腸菌を用いたR5His6の大量生産は不可能であった。そこで，R5His6の生産微生物をグラム陽性菌であるBrevibacillusに変更し，さらに分泌シグナルを付加することによりR5His6を培養液中に分泌生産できることを確認した。また，細胞内画分にもR5His6が確認され，BrevibacillusはR5His6に耐性を有していることも分かった。一方，組換え大腸菌により封入体として大量に得られたシリカテインαは，リフォールディングの条件検討により可溶化することができた。以上により，金属配位能とシリカ形成能を併せ持つことが期待されるペプチドR5His6ならびにシリカ生成反応を触媒するシリカテインαの微生物生産の準備が整った。しかしながら，当初の計画にあった，これらを用いた金属を分子インプリントしたシリカ担体の調製までは到達できなかったことから，やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
前述のとおり，2020年度において遺伝子組換えBrevibacillusおよび大腸菌を用いて，R5His6とシリカテインαの大量生産の目途が立ったことから，本年度はこれらの組換え微生物を用いた最適培養条件を検討し最適化する。一方，固相合成した接着性ペプチドを用いた並行研究において，アミノ酸残基が一部欠落した純度の低いペプチドであっても十分なシリカ接着能と金属結合能を有することを明らかにしている。R5His6のシリカ形成能はその豊富な塩基性アミノ酸配列に起因することが報告されていることから，ペプチド固相合成法により得た，途中のアミノ酸残基が1，2個欠落した純度の低いR5His6においても，シリカ生成能を有している可能性が高く，しかもそれ程高価ではないため，工業利用の可能性がある。そこで，R5His6を合成委託し，純度70％程度のR5His6を用いて白金族金属（白金，ロジウム，パラジウム）を分子インプリントしたシリカ担体の調製を試み，標的金属に対する吸着特性および安定性について明らかにし，研究全体を総括する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症拡大の影響により，国内学会がすべてオンライン開催となり，また国際学会についても中止となったことにより，旅費の支出がなかっ た。また，物品としてゲル撮影装置を購入する予定でいたが，2021年度末まで目的のペプチドの発現量が明確に検出できなかったこと，大学における県外業者の入構規制があっ たことから，2021年度の購入は見送ることとした。なお，純度が低いR5His6においてもシリカ生成能を有している可能性が高いことが想定されることから，未使用額はその合成委託料等に充てる。
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