| 研究課題/領域番号 |
20K12288
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| 研究機関 | 東邦大学 |
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研究代表者 |
吉澤 定子 東邦大学, 医学部, 准教授 (80424703)
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| 研究分担者 |
浅井 鉄夫 岐阜大学, 大学院連合獣医学研究科, 教授 (10509764)
村田 佳輝 東京農工大学, 農学部, 産学官連携研究員 (10526700)
舘田 一博 東邦大学, 医学部, 教授 (20236558)
澤 友歌 東邦大学, 医学部, 助教 (50818531)
青木 弘太郎 東邦大学, 医学部, 助教 (50821914)
臼井 優 酪農学園大学, 獣医学群, 准教授 (60639540)
嵯峨 知生 秋田大学, 医学系研究科, 助教 (80459809)
森 伸晃 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), その他部局等, 医師 (80537374)
原田 和記 鳥取大学, 農学部, 准教授 (80549543)
石井 良和 東邦大学, 医学部, 教授 (90246695)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 市中感染型CDI / One Health / MLST解析 / 伴侶動物 / 家畜 / 土壌 / 市中感染型CDI |
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| 研究実績の概要 |
2021年3月31日までの時点で、275検体を収集した。伴侶動物由来糞便検体は5施設から45件（猫23件、犬22件）採取された。C.difficile陽性率は13件28.9%（猫2件; 8.7%、犬11件; 50％）であり、そのうち3件（犬）から毒素産生株が分離された。MLST解析では、犬ではST 15;4株、ST 26;2株、その他ST 42, ST 3, ST28, ST100, ST 185が1株ずつ、猫はST 203, ST 297が1株ずつ検出された。家畜由来検体は、牛135件（17農場）、鶏41件（７農場）、豚20件（2農場）が採取された。牛における検出率は11%(15/135件)で、毒素産生株の検出率は60%（9/15件）であった。９株についてMLST解析を行い、ST11；5株、その他ST 2, ST 15, ST 58, ST 101が1株ずつ検出された。鶏、豚からは分離されなかった。2施設14例からCACDI患者由来株が採取された。MLST解析では、ST42, ST 37, ST 100, ST 203がそれぞれ2株、ST 224, ST 81, ST 28, ST 47が1株ずつ検出された。2株は分類不能であった。1例は生来健康な1歳女児であり、患者家族からC.difficileは分離されず、患児が日常的に遊ぶ公園（A,B）の土壌を調査したところ、公園Aでは4/４検体（3検体より毒素遺伝子陽性株）、公園Bでは1/4検体（毒素遺伝子陽性株）よりC.difficileが分離された。MLST解析では公園Aの２か所、公園Bの1か所より患児と同じST 42が検出され、SNPs解析により、患児と公園由来株のSNPsは近縁株であることが示唆された。比較対象として2か所の公園C, 公園Dを調査した。公園Cでは2/2検体（100％、ST2）、公園Dでは3/5検体（60％）よりC.difficileが分離された(ST 15, ST42, ST100)。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2020,2021年度で全150菌株を目安に次世代シーケンサー（NGS）によりゲノム解析を行う予定であり、2020年度までにすでに275検体より77株分離し、46株についてMLST解析を行った。詳細を下記に示す。
①：多施設共同研究として、東邦大学医療センター大森病院、東京医療センターにおいてCACDIと判断されるC. difficile臨床分離株を計14株収集し、菌株の解析を行った。
②：多施設共同研究として、家畜（牛135件、鶏41件、豚20件）・伴侶動物由来の便（犬22件、猫23件）、公園の土壌（15件）を採材、C. difficileを分離し、菌株の解析を行った。
③：9歳以下の幼小児2例からC. difficileが分離されたため、保護者の同意を取得し家族の糞便検体を6例より採取した。
④：①②③で得られた46株についてNGSによりゲノム解析を行い、MLST、リボタイプ、毒素産生遺伝子保有状況、耐性遺伝子保有状況について調査し、ヒト由来菌株とその他の試料由来の菌株について比較し、関連性について検討を加えた。
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| 今後の研究の推進方策 |
【2021年度】2020年度に引き続き多施設共同研究としてCACDI由来株を入手するとともに、伴侶動物、家畜、土壌からの菌株の分離を行い、さらにMLST、リボタイプ、毒素産生遺伝子保有状況、耐性遺伝子保有状況について調査し、ヒト由来菌株とその他の試料由来の菌株について比較し、関連性について検討を加える予定である。
【2022年度】上半期はデータ解析、総括を行い、下半期に論文作成、公表する。【菌株解析方法】糞便試料は輸送培地により授受を行い、研究代表者施設にて分離培養を行う。C. difficileであることの確認はCCMAにて分離され、かつL-proline aminopeptidaseテストが陽性となることにより行う。-80℃にて菌株は冷凍保存し、解析時にBHI agarにて保存株から培養を行う。C. difficileに関するドラフトゲノム情報は250株以上が公開されており、NGSによるゲノム解読を、東邦大学微生物感染症学講座が保有するベントチップ型のNGSであるMiSeq（Illumina）を用いて行う。DNAライブラリの調整はNextera XT DNA Preparation Kit(Illumia)を用い、シークエンスデータ解析はCLC genomics workbench,CLC bioを導入している。これらの解析により得られたドラフトゲノムにより、C. difficile に普遍的に存在するとされるhouse-keeping gene(tpi)の解析及びMLST解析、毒素遺伝子解析（tcdA,tcdB,cdtA,cdtB）、さらに耐性因子（gyrA, gyrB, rpoA, rpoB, rpoC）の有無について網羅的に解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
学内共同研究者に関しては、2021年度に2020年度分とまとめて試薬等を購入する予定である。学外共同研究者である嵯峨先生、村田先生に関しては、2020年度に検体の授受が生じなかったため、2020年度の研究費を2021年度に使用する予定である。
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