| 研究課題/領域番号 |
20K12710
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
岡本 美奈 大阪大学, 医学部附属病院, 助教 (50457008)
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| 研究分担者 |
名井 陽 大阪大学, 医学部附属病院, 教授 (10263261)
江副 幸子 大阪大学, 医学系研究科, 特任教授(常勤) (90379173)
大川 竜麻 大阪大学, 医学系研究科, 特任研究員(常勤) (40838520)
HAGHPARAST SEYED・MOHAMMAD・ALI 大阪大学, 医学部附属病院, 特任研究員(常勤) (60838754) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 間葉系幹細胞 / 品質評価 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト組織由来間葉系幹細胞(MSC)の特性は由来組織によっても異なることから、由来組織ごとに品質がどのように変化するか、比較検討を行った。滑膜組織、臍帯組織、骨髄由来のMSCを有血清、無血清培地でそれぞれ培養し、培養初期(P3-P7)および培養後期(P10以降)の各細胞の品質評価を行った。滑膜組織及び臍帯組織由来MSCは当施設において樹立・保管を行っているセルバンクの細胞を使用し、骨髄は市販の細胞を用いて、各細胞の継代数に伴う細胞の形態変化や細胞増殖能、骨・脂肪・軟骨への分化能、フローサイトメトリーによる表面抗原マーカーの解析を行った。
その結果、いずれの細胞も有血清培地と比較して無血清培地下で有意に増殖能が高く、有血清培地では比較的早期に細胞の形態変化が確認された。骨髄由来MSCは他の2種のMSCと比較して、培養初期に増殖能の低下が認められた。分化能の評価では、臍帯MSC及び滑膜MSCでは無血清培地下で培養後期(P14)まで脂肪分化が確認された。骨分化については、無血清培地で培養すると臍帯及び滑膜MSCではP13まで石灰化を確認できたが、 有血清培地ではいずれも良好な結果は得られなかった。骨髄MSCについてはP9まで骨分化および脂肪分化を確認したが、培養後期の分化能については確認中である。また、幹細胞マーカーを用いて表面抗原マーカーを確認した結果、有血清培地下では早期に一部のマーカーの陽性率が低下した。無血清培地下において骨髄MSCでは比較的早期に一部マーカーの陽性率が低下する一方で、臍帯MSC及び滑膜MSCでは培養後期においてもいずれのマーカーも高い陽性率を維持していた。
以上から、細胞の形態変化が認められる老化した細胞でも脂肪の分化能は長期間維持されており、また増殖能が高くてもMSCマーカーの一部で陽性率の低下が認められるなど、品質の評価には注意を要することが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当該年度は、COVID-19の研究実施体制及び当施設の動物実験施設建て替え工事による飼育匹数の制限により、動物を用いた実験系への遅れが生じた。しかし、最も検討期間を要する培養初期から培養後期(P16まで)の各組織由来細胞の細胞増殖能や骨・脂肪・軟骨の分化能、幹細胞マーカーを用いた表面抗原の検討等の品質確認試験を網羅的に実施し、各組織由来MSCの品質変化のタイミングを特定することができたため、次年度以降の安全性評価等の検討は速やかに実施可能であると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
培養早期(P3-P7)と培養後期(P10以降)の滑膜組織、臍帯組織、骨髄由来の各MSCを用いて、安全性評価や免疫抑制効果の検討を行う。安全性評価については、核型分析及び動物を用いた造腫瘍性試験を実施する。核型解析では、G-band解析とAlley-CGHにより染色体異常を解析する。造腫瘍性試験については、各MSC細胞を超免疫不全NOGマウスの背部皮下に投与後、6ヵ月及び1年後の各臓器における造腫瘍性を確認し、細胞の老化に伴う安全性について評価を行う。
また、MSCが有する免疫抑制作用についても検討を行う。比重遠心法にて分離したヒト末梢血単核球(PBMC)とMSCを共培養し、Tリンパ球の増殖抑制について調べ、由来組織間や細胞老化の違いによる抑制効果について解析を行う。さらに、MSCの障害部位へのホーミング作用についての検討を行う。マウスの背部皮下にアテロコラーゲンを担体としたペレットを移植し、各MSCの集積作用を解析する。
初年度において、継代数や由来の異なる組織から分化能が高い細胞、分化能が低い細胞を特定できたころから、それぞれの培養上清中のタンパク質を用いたプロテオミクス解析やエクソソーム中のmiRNA解析などを行い、品質評価のマーカーとなる因子の探索を目標とする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）初年度に実施したフローサイトメトリーを用いた幹細胞表面抗原マーカーの確認については、既に当研究室にて所有している抗体を使用した事、また、当該年度はCOVID-19による影響で研究の実施が制限されたことにより、特に動物実験にかかる使用額等について相違が生じた。初年度に実施予定であった核型解析の外注については、培養後期の細胞の回収に時間を要し、また、由来組織によって細胞の老化のタイミングが異なることが明らかになった事から、各細胞の品質が変化する培養後期の継代数の特定を行い、次年度に実施することとした。
（使用計画）
培養に使用する無血清培地は比較的高価であるが、維持培養のため、コンスタントに購入が必要となる。培養早期及び培養後期の各細胞の核型解析の外注や免疫不全マウスを用いた安全性評価については次年度に実施する。また、傷害部位へのMSCの集積作用の検討を行うため、特性解析に必要な動物の購入や免疫組織染色等にかかる試薬の購入が必要となる。さらに、MSCの免疫抑制効果の検討を実施予定であり、細胞や各種抗体、フローサイトメトリーの実施に必要な生化学関連試薬を購入予定である。
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