| 研究課題/領域番号 |
20K15143
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
箕嶋 渉 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 特任助教 (70802875)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 培養神経ネットワーク / 微小電極アレイ / 同期バースト / レーザー / 顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
初年度となる2020年度は、培養神経回路網の電気的活動が単発活動から同期的に変化する過程を多角的に測定する計測システム構築に従事した。当初、顕微ラマンイメージングを優先的に進めることを予定していたが、研究機関を異動したことで光ピンセット顕微鏡システムを優先して構築した。光ピンセット用レーザー光である波長1064 nmのYVO4レーザーを正立顕微鏡に導入し、60倍水浸（NA 1.2）または100倍油浸（NA 1.3）対物レンズで細胞試料表面に集光するシステムを構築した。構築したシステムで粒径100 nmの蛍光性ポリスチレンナノ粒子を光捕捉し、一粒子トラッキングにより捕捉中のナノ粒子の軌跡を解析することで光捕捉安定性を解析した。結果として、従来の倒立顕微鏡光ピンセットシステムと同等の捕捉安定性を持つことを明らかにした。2021年度以降、神経シナプス活動を光ピンセットにより制御し、その過程で変化する神経電気活動を計測する予定である。
また、最終目標の一つであるシナプス伝達可視化を目的とした、計測プローブを検討した。顕微ラマンイメージングにより興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸を検出することは伝達可視化に大きく貢献すると考えられる。しかしながら、グルタミン酸由来のラマン散乱光が細胞試料由来の強いラマン散乱光に埋もれてしまうこと、が原因で検出が難しいため、重水素置換されたグルタミン酸を使用により細胞由来のラマン散乱が少ない波数領域に出現させることを検討した。基礎検討として、培養神経回路において重水素置換グルタミン酸が通常のグルタミン酸と同様に作用することを示した論文が掲載され、今後は重水素置換グルタミン酸を細胞内に導入する方法を検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実施機関の異動と新型コロナウイルス感染拡大に伴う実験禁止により一時的に実験ができない期間が生じたが、当初の目的としていた正立顕微鏡にレーザーを導入した計測システムを構築した。構築した光ピンセットシステムの光捕捉安定性を検証するため、粒径100 nmの蛍光性ポリスチレンナノ粒子を光捕捉し、粒子からの蛍光をCMOSカメラで取得した。一粒子トラッキング解析により、光捕捉されたナノ粒子の軌跡を評価した。結果として、新規構築した正立顕微鏡光ピンセットでも従来の倒立顕微鏡と同様の光捕捉が可能であることを示した。今後は多電極アレイ上に培養した神経回路を対象とし、光捕捉過程での神経活動計測を進める予定である。
さらに、レーザー顕微鏡システムによるシナプス伝達の高感度検出を目的とし、重水素化グルタミン酸が培養神経回路において通常のグルタミン酸と同様の作用を持つことを評価した基礎検討結果が英文論文誌に掲載された。今後は重水素化グルタミン酸を神経細胞内に導入する方法を検討し、細胞内外での顕微ラマン散乱イメージングに用いる予定である。
以上の理由から、光ピンセットおよび顕微ラマンイメージングの実験が本格的に進むことが予想されるため、本申請課題は「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度以降は構築した顕微鏡システムを使用し、多電極アレイ上に展開した培養神経回路に光ピンセット用レーザー光を照射し、並行して神経活動を細胞外電位として測定する。実験結果を解析し、光捕捉過程における神経活動変化を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入を予定していた対物レンズを現所属機関が所有していたため購入の必要がなかったこと、新型コロナウイルス感染症関連の実験停止により消耗品の購入総額が当初予定されていたものより少なくなったた。次年度使用額は、対物レンズ購入費と実験関連消耗品費に算入する予定である。
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