2020 年度実施状況報告書

画像解析と機械学習を組み合わせた新技術で解き明かす微生物集団構築プロセス

研究課題

研究課題/領域番号	20K15427
研究機関	筑波大学
研究代表者	高部響介筑波大学, 生命環境系, 助教 (60821907)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2024-03-31
キーワード	バイオフィルム / 不均一性 / 1細胞解析 / 画像解析 / 機械学習
研究実績の概要	地球上の微生物のほとんどは集団（バイオフィルム）を形成し生活を営んでおり、我々人類は正負の両面において、様々な場面でバイオフィルムと関わっており、その集団性を深く理解することが重要である。バイオフィルム内では同一遺伝子型でさえ細胞ごとに遺伝子発現等に不均一性が生じることが知られており、集団内で役割分担（機能分化）が行われていると考えられている。しかしながら、従来の手法では2種類程度の細胞しか追跡することができなかったため、集団構築プロセスにおいて「いつ、どこで、どのような機能分化が生じるのか」といった基礎的な知見は依然蓄積されていない。本研究では、これまで困難であった機能性を発揮する細胞を複数種追跡する新規のモニタリングシステムを構築することを目指す。具体的には共焦点顕微鏡システムにより、細胞の生理状態を反映する自家蛍光的特徴を1細胞レベルで取得し、その特徴量と細胞機能（細胞外多糖生産・細胞外DNA放出など）を機械学習的手法により関連付けることにより、ラベル処理なく自家蛍光を観るだけで集団内での機能分化を直接観察・追跡することを可能とする技術の開発を目指すこととした。微生物集団は複雑な3次元的な構造体であり、従来の画像解析手法ではノイズシグナルの多い微生物集団の顕微鏡画像の1細胞から発せられる自家蛍光を抽出することは困難であった。そこでまず、モデル微生物である緑膿菌の細胞が持つ自家蛍光を1細胞毎取得することを目指した。ノイズ低減フィルタ処理等を組み合わせた独自の画像解析アルゴリズムを構築することにより、1細胞領域を3次元的に認識し、1細胞毎の自家蛍光的特徴を抽出することに成功した。集団内の個々の細胞の自家蛍光には不均一性が生じていることが明らかとなり、集団内での役割によって自家蛍光的特徴が変化している可能性が示唆された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由令和2年度は、バイオフィルム内の個々の細胞領域を認識するための画像解析アルゴリズムの構築を主として行う予定であった。従来のバイオフィルム内の1細胞解析、つまり1細胞領域認識には、細胞を蛍光標識することにより、選択的に細胞領域のみの画像を取得することで解析を容易にしていた。しかしそれでは、標識した蛍光物質により、自家蛍光情報は取得できないため、共焦点反射顕微鏡法（CRM）を用いた。CRMは、蛍光タンパク質の導入等の前処理をせずに3次元的に分布するバイオフィルムを観察できる。しかしながら予想通り、非常に密に集団を構築するバイオフィルムのCRM像は細胞領域以外のシグナルも反映しており、ノイズシグナルが多く取得された。そこで、ノイズ低減フィルターを導入した、1細胞領域を認識するための新規の画像解析アルゴリズムを構築した。その結果、バイオフィルム集団内の1細胞領域を3次元的に認識でき、集団内の1細胞毎の自家蛍光的特徴を抽出することに成功した。その結果、集団内の個々の細胞の自家蛍光には不均一性が生じていることが明らかとなった。さらに、統計的手法を用いた解析により、バイオフィルム内の不均一性の度合いが、集団構築プロセス内で変化することも明らかとなった。これらの結果は、集団内での役割によって自家蛍光的特徴が異なることを示唆し、さらにバイオフィルムの成熟段階によって役割分担の様子が変化することを示している。本年度中に、予定していた1細胞毎の自家蛍光的特徴を抽出する画像解析アルゴリズムを構築できたことから、おおむね順調に進展していると考えられる。
今後の研究の推進方策	これまでの成果から、集団内の1細胞毎の自家蛍光には不均一性が生じていることが明らかとなった。初年度で集団内の1細胞レベルでの解析手法は確立することができたと考えている。したがって、今後は自家蛍光的特徴と機能分化の関連性を主として調べていく。具体的には、自家蛍光像を取得した後、蛍光染色によってEPS生産株や死細胞、細胞外DNAを放出する株を選択的にマーキングし、機能性ラベル画像を取得することにより、それぞれの種類の機能性細胞の自家蛍光データを蓄積させていく。令和3年度はデータの収集を中心に活動を行う予定である。得られた大量のデータを基に、ディープラーニングによる分類モデルを構築し、複数種の機能性細胞を追跡する技術の開発を目指す。