| 研究課題/領域番号 |
20K15436
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
阪本 鷹行 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 助教 (90740332)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 10-ヒドロキシオクタデセン酸 / Fusarium属 / Ohy |
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| 研究実績の概要 |
一部の嫌気性細菌が生産する水酸化脂肪酸である10-ヒドロキシオクタデセン酸 (HYA) は、構造の特性から石油代替ポリマーの原料として注目されている。しかし、細菌は脂質生産性が極めて低く、育種が進んでいない。また、観察困難であるためHYA合成・蓄積・代謝のメカニズムは未解明である。本研究では、申請者らによって初めて報告されたHYA生産性糸状菌Fusarium属を用い、HYA合成メカニズムの解明と、HYA高生産株の育種を目的とした。
HYA生産性バクテリアの知見を基に、水酸化脂肪酸生産に関与する脂肪酸水和酵素を推定し、大腸菌を用いて推定水和酵素D2Ohy2を精製した。さらに、D2Ohy2の至適pHと至適温度を検討した結果、pH 5.0および45 ℃で最も高い活性を示した。これらの至適条件は既報のバクテリア由来水和酵素に比べて低いpHおよび高い温度であり、D2Ohy2がバクテリア由来の酵素とは異なる性質を持つことが明らかとなった。即ち、反応熱に耐性があるD2Ohy2は、酵素法によるリアクター開発にアドバンテージがあると言える。
HYA生産後のFusarium属菌D2株を好気条件下で培養しつづけ、脂肪酸のβ酸化誘導を試みたところ、HYAを含むすべての貯蔵脂質が一様に減少した。この結果は、HYAがその他の脂肪酸と同様にエステル化されて油滴小胞内に貯蔵される、および消費さることを示唆している。一方、HYAのβ酸化物や代謝中間体に当たる鎖長が短い脂肪酸は検出されなかった。したがって、HYA代謝が非常に速やかである、あるいは水酸基を基点とした環状化によって現行法では検出できない物質に変換された可能性が示された。今後は、想定される環状物質であるラクトンなどを解析し、代謝経路の追及を試みる。また、脂肪酸蓄積およびβ酸化に関連する遺伝子を標的とした分子育種によってHYA高生産株育種を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究の課題は大きく分けて、1.HYA合成関連遺伝子の探索、2.HYA合成酵素（Ohy）の機構解析、3.HYA代謝産物の解析、の３点から成る。これらのうち、2.についてはOhyが菌体内に局在する酵素であることを示唆し、さらにその活性特性を明らかにしたため、大いに進展していると言える。今後は細胞内の局所的な観察を行い、菌体内の脂肪酸との相互作用様式を解析する必要がある。
1.についてはトランスクリプトーム解析の結果からOhyが二次代謝的な発現様式でないことが示されたが、Ohyの発現調節やさらに下流で働く遺伝子の探索に至っていない。
3.について、HYAが他の貯蔵脂質と同様の蓄積・代謝機構によって消費されることが示唆された。一方、HYAの酸化物である10-オキソオクタデセン酸よりも下流の代謝産物は検出されていない。今後は、嫌気性細菌で報告がある共役リノール酸などの分析だけでなく、1.の結果を踏まえて脂肪酸以外の代謝産物を探索し、HYA代謝メカニズムと生化学的機能の解明を試みる必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
Ohyは菌体内酵素であると推察されるため、今後はGFP融合タンパク発現株を構築し、菌体内局在を観察して、脂肪酸との相互作用様式を解析する予定である。
また、HYA合成酵素（Ohy）の脂肪酸に対する諸性質については明らかにした。一方、Ohyは基質となる遊離脂肪酸非存在条件においても発現することが示されたため、脂肪酸以外の化合物を基質とする可能性がある。今後、脂肪族アルコールなどの構造類似物質について、Ohyの基質となる化合物の探索、および代謝産物の解析も視野に入れている。
HYA代謝機構について、短鎖脂肪酸やラクトンなどの想定される化合物を広く解析する必要がある。さらに、Ohy破壊株を構築し、HYAを外部添加することでOhyの下流で働く代謝因子の再探索を試みる。
一方、Ohyを制御する上流因子の解析については、Ohyと同様に恒常発現を示した転写因子やシグナル伝達因子の遺伝子破壊株を構築し、Ohy発現との相関を調べることを予定している。しかし、恒常発現遺伝子は菌体生育に大きく影響する可能性があるため、機能解析が困難であると予想される。そのため、薬剤などを用いた突然変異誘発によるHYA産生能欠損株の構築を試み、得られた変異株における変異点解析からOhy発現調節因子の特定を試みることを想定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
R2年度、R3年度のいずれも、新型コロナウイルス感染症拡大防止対策に伴って物資の調達や活動の制限が研究進行の律速となったため、研究の延長を決定した。
引き続きFusarium属菌D2株の培養を行うため、培養基や培地試薬などに約50万円、さらに遺伝子組換えに要する試薬として比較的高価な酵素類に約100万円の消耗品費を想定している。
また、遺伝子組換え株のOhy局在観察および評価に共焦点レーザー顕微鏡を使用する。顕微鏡については徳島大学保有の共通機器があり、レンタル料として約50万円を想定している。
HYAおよびHYA代謝産物の解析に用いるガスクロマトグラフィーカラムに約50万円を想定している。
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