| 研究課題/領域番号 |
20K15447
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
齋藤 俊也 東北大学, 工学研究科, 学術研究員 (00825226)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / 植物 / リン酸化酵素 / 膜タンパク質 / 電気生理学 |
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| 研究実績の概要 |
【①ホスホプロテオミクス解析による各種ストレスに対応した孔辺細胞キナーゼ・チャネルリン酸化部位の同定】当初は孔辺細胞プロトプラスト(以下GCP)を用いたホスホプロテオミクス解析を最初に行い、ストレス時にはたらくチャネル・キナーゼを一挙に同定する予定であったが、調製したGCPのコンディションに問題があったため、ストレス試験に使用可能なGCPの調製に向け現在実験プロトコルを最適化中である。
【酵母・大腸菌を用いたキナーゼ・チャネルのスクリーニング】①の解析が当初の予定より大幅に遅れているため、代替実験である酵母・大腸菌を用いたキナーゼ・チャネルのスクリーニングも同時並行で実施している。K+チャネル欠損酵母(もしくは大腸菌)にKAT1・KAT2・AKT1・AKT2・GORK・KC1をそれぞれ導入し、これら導入株に各CBL-CIPKの組み合わせを共発現させ、様々なK+濃度の培地での生育を比較した結果、いくつかのCBL-CIPKの組み合わせでK+チャネルが特異的に機能調節されることが分かり、現在結果を解析中である。
【②電気生理測定によるキナーゼ・チャネルリン酸化部位の対応関係の解析】①の解析が予定より遅れているため、①の結果を待たず、まずは既知の気孔チャネル活性化キナーゼに関して、疑似リン酸化・脱リン酸化変異チャネルを用いたリン酸化部位の解析を試みた。しかし、20個近くもの候補アミノ酸について本実験を行うもリン酸化部位の特定に至らなかった。そこで現在は手法を転換し、卵母細胞を利用したLC-MS/MSによるチャネルリン酸化部位の実験系を立ち上げている。
【③蛍光プローブを用いた気孔の複合ストレス応答解析】本実験で使用予定の蛍光プローブは、孔辺細胞をプロトプラスト化させた際の実験データが不安定であること明らかとなった。そのため、作用環境の最適化とプローブ自体の改良を進める予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
当初は１年目でGCPを用いたホスホプロテオミクス解析を完了させ、その結果をもとに２年目から電気生理測定を中心とした解析を行う予定であった。しかし、コンディション良好なGCPの大量調製が予想以上に困難であり、実験プロトコルの最適化が必要であった。また、本実験で使用予定の蛍光プローブに関しても、孔辺細胞をプロトプラスト化させた際の実験データが不安定であること明らかとなったため、作用環境の最適化とプローブ自体の改良が必要となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
GCPホスホプロテオミクス解析の実験プロトコル最適化と、蛍光プローブの改良・作用環境の最適化を行う。また、電気生理測定によるキナーゼ・リン酸化部位の対応関係解析は、当初GCPホスホプロテオミクス解析(１年目)の結果をもとに行う予定であったが、予定を変更しGCPホスホプロテオミクス解析の実験系立ち上げと同時並行で電気生理測定を行う。その手法に関しても、電気生理測定でキナーゼによるチャネルの活性制御を確認した後に、同じ卵母細胞でLC-MS/MSによるチャネルリン酸化部位の検出を行うという手法に転換する。既に同実験系の立ち上げは進行中であり、いくつかの種類のキナーゼにおいてSLAC1の特定のアミノ酸残基におけるリン酸化率の変動を観測することに成功している。
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