| 研究課題/領域番号 |
20K15459
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
若林 孝俊 神戸大学, 農学研究科, 助手 (20843858)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ストリゴラクトン / 根寄生植物 / 植物ホルモン / 生合成 / シトクロムP450 |
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| 研究実績の概要 |
ササゲおよびトマトのVuCYP722C、SlCYP722Cは、典型的SLのorobancholの生合成に関与する。CYP722Cサブファミリーは双子葉植物に広く保存されているため、この酵素が典型的SLに必須のBC環形成に関与していると考えられた。本年度は、orobancholとはC環の立体が異なるSLの5-deoxystrigol（5DS）を生産するワタのGaCYP722Cの機能解析を実施した。昆虫細胞発現系によりタンパク質を異種発現させ、それを用いたin vitro酵素アッセイを行った。その結果、GaCYP722Cがcarlactonoic acid（CLA）から5DSへの立体選択的な変換反応を触媒することを見出した。また、近年、ミヤコグサにおいて、5DSが欠損した5-deoxystrigol defective（DSD）変異体が報告され、その原因遺伝子はLjCYP722Cであった。これらのことから、CYP722Cは典型的SL生合成のための鍵酵素であると結論づけた。一方、ミヤコグサはCYP722Cを2コピー有している（DSD/LjCYP722C-1、LjCYP722C-2）ため、これら２つの酵素機能解析を行った。しかし、GaCYP722Cとは異なり、CLAから5DSへの選択的な変換反応は触媒しなかった。
また、単子葉植物におけるCYP722Bサブファミリーとして、イネおよびソルガムのOsCYP722B、SbCYP722Bの機能解析を行った。その結果、これら２つの酵素は、CLAを基質とした反応を触媒したが、典型的SLへの変換を触媒しなかった。
トマトにおけるSlCYP722Cノックアウト体（KO体）を用いた新規SLの探索については、KO体抽出物をLC-MS/MSで分析した結果、複数のSL関連化合物と思われるピークを検出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画に従って、CYP722ファミリーの機能解析を進めることができ、それらの酵素機能に関する知見が集積されつつある。さらに、初年度開始時には論文化されていなかった、ソルガムの典型的SL生合成に関わるsorgomol合成酵素について、国際学術誌にて報告した
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度も、初年度に引き続き、CYP722ファミリーの詳細な酵素機能解析を行う。ミヤコグサのLjCYP722C-1/DSDおよびLjCYP722C-2については、それぞれの遺伝子の変異体を利用し、生産されるSLプロファイルを解析することで、これらの酵素機能の理解を深める。
LjCYP722Cに加え、OsCYP722BおよびSbCYP722Bについては、ベンサミアナタバコを用いたアグロインフィルトレーション法による一過的タンパク質発現システムにより、その機能を検証する。すなわち、CLAを合成するためのSL生合成のコア経路に関与する、D27、CCD7、CCD8およびMAX1ホモログと、ターゲットであるCYP722C/CYP722Bを同時に発現させることで、タバコ葉内在のβ-カロテンを基質としてSLを合成させる。合成されたSLをLC-MS/MSを用いて分析し、標品と比較することで構造を決定あるいは推定し、CYP722C/CYP722Bの機能を調べる。
KO体を利用した新規枝分かれ抑制ホルモンの探索については、植物体の抽出物量を増やしLC-MS/MSで分析する。この際、SL特有のフラグメントイオンであるm/z 97を持つ化合物を探索する。KO体では典型的SLが欠損しているのも関わらず、枝分かれが増加しないため、非典型的SLが枝分かれ抑制ホルモンとして機能していると考えられる。まずはKO体と野生型のSLプロファイルを比較し、KO体で蓄積している化合物、あるいは共通して存在する化合物を探索する。検出されたSL関連化合物については、HPLCによる精製を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の感染防止のため、発表を予定していた国内外の学会がなくなったため、次年度使用額が生じた。次年度では主に消耗品の購入に使用する予定である。
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