| 研究課題/領域番号 |
20K15532
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
宮田 佳奈 明治大学, 研究・知財戦略機構(生田), 研究推進員(客員研究員) (10637143)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 植物-微生物間相互作用 / Paraspoia / LysM型受容体キナーゼ / 根粒菌共生 / キチン誘導性防御応答 |
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| 研究実績の概要 |
Parasponiaは非マメ科であり根粒菌と共生する木本植物である。ParasponiaのLysM型受容体キナーゼ、PanLYK3は、根粒菌共生とキチン誘導性防御応答という対照的な２つの応答において重要な機能を持つ。Parasponiaの根粒菌共生は、PanLYK3とPanNFP2という受容体が複合体を形成することで誘導されると考えられている。しかし、PanLYK3と共に防御応答に関わっている受容体は未だ明らかになっていない。
本研究では、キチン誘導性防御応答に関わる受容体として、LysMモチーフを持つ3つのタンパク質を候補として挙げている。それらの候補遺伝子の欠損変異体を作成し、防御・共生における応答の評価を行うことにより、PanLYK3と複合体を形成してキチン誘導性の防御応答の起動に関わる受容体を同定し、機能解析を通して防御応答と共生応答が選択的に起動されるメカニズムの解明を目指している。
本年度は、共生応答の下流応答である核周辺のCa2+濃度の変動（Ca2+スパイキング）に関して、Parasponiaで検出するための手法の確立を行い、これまでに行った結果をまとめて、植物微生物研究会第30回研究交流会で報告した。さらに、キチン処理時におけるMPK3/6のリン酸化や根粒菌共生時の根粒菌側のマーカー遺伝子の発現解析などを行い、前年度の成果と合わせて、Parasponiaでのキチン誘導性防御応答及び根粒菌共生の表現型解析に必要な実験条件を確立がほぼ完了した。また、BiFC法を用いて候補遺伝子である受容体タンパク質とPanLYK3との相互作用解析を行った結果、候補受容体の一つに関して、PanLYK3との結合が示された。現在、特にこの１つの候補遺伝子に関して欠損変異体の作成を行っており、獲得出来次第、表現型の評価を通して、キチン誘導性防御応答において機能する受容体の同定を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、Paraseponiaにおける共生および防御応答の指標の評価方法の確立のため、防御応答に起因するMPK3/6リン酸化の検出に関して条件検討を行い、キチンを処理した野生型の根において明瞭なリン酸化を検出に成功した。さらに、根粒菌M.を接種したParasponiaの根粒において、共生が起こる際に誘導されてくる根粒菌の遺伝子nifHの高い発現を確認できた。前年度までの成果と、これらの研究から、Parasponiaにおいて防御応答と根粒菌共生に関する評価に必要な手法は概ね確立が完了した。
また本年度は、特にParasponiaにおける形質転換を中心に作業を行った。Ca2+スパイキング解析に必要なGECOタンパク質を、Parasponiaで高発現させた形質転換体を、複数ライン獲得することに成功した。顕微鏡観察の結果、核付近で蛍光が確認されており、形質転換自体は成功していると考えられる。現在これらの形質転換ラインを用いて、Ca2+スパイキングの検出に向けて実験を継続している。同様に、Parasponiaの近縁種であり、根粒菌共生を行わないTremaに関しても、同様にGECOを過剰発現させた植物体の獲得に向けて、形質転換を行っている。
候補遺伝子の欠損変異体の作出についても継続して行っているが、ベクター配列に一部欠損があったことや、温室内での害虫の発生などのトラブルがあったことから、未だ変異体は得られていない。ベクターは再作成を行い配列が設計通りであることを確認し、現在再度形質転換を行っている。形質転換は特に、BiFC法の結果でPanLYK3と結合が見られた1つの候補遺伝子に関して、集中して変異体の作出を行っている。形質転換体の獲得は年度末から春ごろを見込んでおり、概ね当初の計画の予定通り進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
現時点までで、十分な量の試料の確保と、GECOタンパク質を過剰発現したParasponiaの獲得、キチン応答と根粒菌共生の表現型の確認手法の確立までが終了しており、前述の通り概ね当初の予定通りとなっている。欠損変異体の作出に関しては、本年度中の獲得を目指していたが、トラブルが重なったことなどから若干遅れが生じている。また、現時点で調べる限り想定していたよりも変異導入の確率が低い可能性がある点に関しては、形質転換に用いる植物体の数を増やすことで対応していきたいと考えている。また、形質転換に用いるParapsoniaの量を増やすと同時に、特に可能性の高い1つの候補遺伝子の形質転換体に関して、現在集中して作出を行っている。来年度の前半には変異体の作出を終え、表現型の評価に移りたいと考えている。
来年度に関しては、候補遺伝子の欠損変異体の作出と、Ca2+スパイキングの検出手法の確立を目指す。欠損変異体が獲得出来次第、これまで検討してきた実験手法を用いて表現型の解析を行う。具体的には。候補受容体の欠損変異体におけるキチン誘導性の防御応答として、ROS応答と、MPK3/6リン酸化解析と、根粒菌共生の表現型として、根粒菌接種時の根粒数の解析と、nifHの発現解析、および根粒菌共生のシグナル分子であるNodファクター、およびキチン7量体処理時に起こるCa2+スパイキングの解析を行う。これらの結果から、Parasponiaにおいてキチン応答に関与する受容体を明らかにする。変異体の表現型解析で明瞭な結果が得られ次第、論文の執筆を行い、国際誌への投稿を目指す。また、来年度も引き続き、国内外の学会に積極的に参加していきたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度において感染症拡大の影響で、Parasponiaの輸送に当初予定していた以上の時間がかかり、その分実験に遅延が生じている。また、候補受容体変異体の作出過程においてマイナートラブルが生じており、形質転換体の作出に時間がかかっていることも影響している。現在、形質転換体の作出が完了した後の評価方法の確立はほぼ完了しているが、形質転換体の作出が完了していない。予算を多く計上しなけばならないのは形質転換体の作出が完了した後であり、この実験は2022-2023年度に多く予定されている。
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