| 研究課題/領域番号 |
20K15532
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
宮田 佳奈 明治大学, 研究・知財戦略機構(生田), 研究推進員(客員研究員) (10637143)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 植物―微生物間相互作用 / Parasponia / キチン誘導性防御応答 / LysM受容体型キナーゼ / 根粒菌共生 |
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| 研究実績の概要 |
Parasponiaは非マメ科であり根粒菌と共生する木本植物である。ParasponiaのLysM型受容体キナーゼ、PanLYK3は、根粒菌共生とキチン誘導性防御応答という対 照的な２つの応答において重要な機能を持つ。Parasponiaの根粒菌共生は、PanLYK3とPanNFP2という受容体が複合体を形成することで誘導されると考えられている。しかし、PanLYK3と共に防御応答に関わっている受容体は未だ明らかになっていない。 本研究では、キチン誘導性防御応答に関わる受容体として、LysMモチーフを持つ3つのタンパク質を候補として挙げている。それらの候補遺伝子の欠損変異体を 作成し、防御・共生における応答の評価を行うことにより、PanLYK3と複合体を形成してキチン誘導性の防御応答の起動に関わる受容体を同定し、機能解析を通 して防御応答と共生応答が選択的に起動されるメカニズムの解明を目指している。
本年度は、特にParasponiaの野生型から候補遺伝子に対する変異体の獲得を目指して実験を行った。複数回の形質転換を行ったが、形質転換体を得るには至らなかった。ベクター上の配列を調べたところ、類似した配列がヘアピン構造を作り大幅に欠損していることが明らかになった。そこで、ベクターを作り直し、形質転換を行い得た個体に関して、現在配列の解析を行っている。今後は、変異体の獲得を最優先として、複数回の変異体の獲得を試みるとともに、異なるガイドRNAに対するベクターを用いて形質転換体の誘導も行っていく予定である。形質転換体が獲得され次第、表現型の評価を通して、キチン誘導性防御応答において機能する受容体の同定を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、候補遺伝子の欠損変異体の作出について継続して行っている。しかし、ベクター配列の中で、ターミネーターが向き合った形で同じ配列になっており、ヘアピンを作って大幅な欠損になっていることが、ベクター配列の確認から明らかになった。そこで、一からベクター配列の構築を行い、ターミネーターと遺伝子の組み合わせや方向、場所などを大幅に変更した。このベクターの構築の問題に加え、温室内での害虫の発生などのトラブルがあり、植物体を一から育てなければならなくなった。本年度は、ベクターの作成及び形質転換体に用いる植物の生育に時間を割いた。
本年度、新しいベクターを用いて形質転換を行ったが、残念ながら現時点で目的の候補遺伝子の欠損変異体は得られていない。形質転換時に同時に入れた蛍光タンパクであり、Ca2+イオンの周期変動（Ca2+スパイキング）検出の為のR-GECO1.2に関しては導入が見られていることから、問題は形質転換ではなく、ゲノム編集による点変異の誘導の部分であると考えられる。今後は、変異体の獲得を最優先として、さらに複数回変異体の獲得を試みるとともに、異なるガイドRNAに対するベクターを用いて、形質転換体の誘導も行っていく予定である。形質転換体が獲得され次第、表現型の評価を通して、キチン誘導性防御応答において機能する受容体の同定を目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、表現型の解析に用いる評価系の確立は終了しているが、形質転換体の獲得に至っていない状態である。新しく設計したベクターを用いて形質転換を行っているが、残念ながら未だ期待される結果は得られていない。まずは形質転換の個体数を増やして同実験を引き続き行うとともに、GECOタンパク質を抜いた条件や、異なるガイドRNAを設計し、新たにベクターを作成することで変異体の獲得を行う。形質転換体の獲得に対して問題が続くようであれば、本ベクターの供与元であるオランダのワーゲニンゲン大学におけるRene Geurts博士と連絡を取りつつ、研究を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度において感染症拡大の影響で、Parasponiaの輸送に当初予定していた以上の時間がかかり、その分実験に遅延が生じている。また、候補受容体変異体の作出に時間がかかっていることも影響している。現在、形質転換体の作出が完了した後の評価方法の確立はほぼ完了しているが、形質転換体の作出が完了していない。予算を多く計上しなければならないのは形質転換体の作出が完了した後であり、この実験は2022-2023年度に多く予定されている。現在形質転換体の獲得を急いでいるが、以上の理由で予算の使用の時期に変更が生じている。
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