| 研究課題/領域番号 |
20K15553
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
李 超鋒 東京大学, アジア生物資源環境研究センター, 特任研究員 (30866687)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | miRNA / 菌根形成 / 分子メカニズム / 遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
（i）ポプラのmiRNAをデータベースmiRBase（www.mirbase.org）から網羅的に探索し、pre-miRNAと成熟miRNAの配列を取得しました。この中で、既報の文献の情報を参考に、外生菌根菌Laccaria japonicaとCenococcum geophilumの共生に関与が期待されるポプラのmiRNA（miR156, miR171, miR393,miR396）を探索しました。
（ii）次に、psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/.）を用い、これらのmiRNAの制御するターゲット遺伝子を予測しました。
（iii）遺伝子組み換えとゲノム編集のためのポプラの無菌苗を作成しました。目的のmiRNAを過剰発現させるベクター、CRISPR/Cas9になる目的miRNAをノックダウンするためのベクター、またmiRNAの発現部位を特定するためのプロモーターのベクターを、それぞれ構築しました。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新型コロナウイルスの影響で、研究室の在室時間が短縮され、また、研究室の引っ越しのため、新施設にライフサイエンス実験施設（遺伝子組み換え生物等の第二種使用等の実験室Ｐ１Ｐ）設置として申請許可の承認が遅れたため、一部の実験（野生型のポプラにL. japonicaを接種し、菌根形成を評価する、またそれぞれの根端の切片を作成し、菌根形成の状態を調べる）はできなくなってしまいました。アグロバクテリウム法により、それぞれのベクターをポプラに導入ができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
（i）アグロバクテリウム法により、それぞれのベクターをポプラに導入し、アンピシリン/ハイグロマイシンを含む培地でスクリーニングし、導入陽性のポプラ変異個体を得る。
（ii）それぞれの変異体ポプラと、野生型のポプラにLaccaria japonicaとCenococcum geophilumを接種し、菌根形成を評価する。またそれぞれの根端の切片を作成し、菌根形成の状態を調べる。これらにより、どのmiRNAが菌根形成に関与するのかを明らかにする。
（iii）以降の実験をにおいて菌根形成に関与が示されたmiRNAについて行う。野生型と変異体とで菌根形成に差があるポプラから、miRNAを抽出する。Degradome-Seqを用い、目的のmiRNAが実際にで候補としたターゲット遺伝子の転写産物（mRNA）をどの程度分解しているのか検証する。これと同時に、RNA-seqによる転写産物の測定、qPCRを行い、候補遺伝子の発現を調べる。
（iv）さらに、Yeast-two hybrid assay、二分子蛍光補完法（Bimolecular Fluorescent Complimentary: BiFC）、プルダウンアッセイなどの手法によりタンパク質の相互作用を明らかにし、菌根形成におけるターゲット遺伝子の生体内における実際の機能を目指す。
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