| 研究課題/領域番号 |
20K15683
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
亀島 聡 北里大学, 獣医学部, 助教 (80826363)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 変性性僧帽弁疾患(MMVD) / 心臓弁間質細胞(VIC) / トランスフォーミング成長因子(TGF)β / 骨形成タンパク質(BMP) / メトホルミン / BAMBI / Protein phosphatase (PP) |
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| 研究実績の概要 |
弁膜の変性を原因とする変性性僧帽弁疾患(MMVD)は犬で最も多い心疾患である。現在、この弁膜変性を直接抑制する治療薬はない。トランスフォーミング成長因子(TGF)βおよび骨形成タンパク質(BMP)は、心臓弁間質細胞(VIC)の形質転換を介してMMVDにおける弁膜変性を誘導・促進する。2型糖尿病治療薬であるメトホルミンは、様々な細胞においてTGFβまたはBMPによるシグナル伝達を抑制することが報告されている。私はこれまでに、ラットVICにおいてメトホルミンがTGFβおよびBMPに対する偽受容体であるBMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI)のmRNA発現レベルを増加させることを発見していた。よってメトホルミンがBAMBI発現増加を介してTGFβ/BMPによる弁膜変性を抑制すると推測される。そこで令和2年度(1年目)は、TGFβ1またはBMP4によるラットVICにおけるシグナル分子の変化および形質転換(筋線維芽細胞様または骨芽細胞様変化)に及ぼすメトホルミンの影響を検討した。メトホルミンは、TGFβ1によるSmad2/3のリン酸化および筋線維芽細胞マーカーであるα-smooth muscle actin (SMA)の発現増加を、またBMP4によるSmad1/5のリン酸化をそれぞれ抑制した。またメトホルミンは、TGFβ1によるSmad2の核内移行を抑制した。加えてメトホルミンは、BAMBIのみならず脱リン酸化酵素であるprotein phosphatase (PP)2A-Cα/βおよびPP2CαのmRNA発現を増加させた。以上の結果から、メトホルミンはBAMBIだけでなくPPの発現増加を介してTGFβおよびBMPによるシグナル伝達を抑制する可能性が示唆された。現在、その詳細なメカニズムの解明に向けた検討を継続している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和2年度(1年目)は、TGFβまたはBMPによるラットVICの形質転換(筋線維芽細胞様または骨芽細胞様変化)に及ぼす2型糖尿病治療薬メトホルミンの影響を検討した。ラットから心臓房室弁を摘出し、コラゲナーゼ処理によりVICを単離した。なお、免疫蛍光染色法により単離した細胞がVICであること(α-SMAおよびCD31：陰性、vimentin：強陽性)を確認し、各実験に使用した。TGFβ1の短時間処置によりシグナル分子Smad2/3のリン酸化が亢進し、メトホルミン前処置はこれを抑制した。また、TGFβ1の長時間処置により筋線維芽細胞マーカーであるα-SMAの発現レベルが増加し、メトホルミン前処置はこれを抑制した(第163回日本獣医学会学術集会において発表)。一方、メトホルミンはBAMBIだけでなく、Smad2/3を脱リン酸化させるPP2A-Cα/βおよびPP2CαのmRNA発現レベルを増加させた。また、TGFβ1処置はSmad2タンパク質の核内移行を促進し、メトホルミン前処置はこれを抑制した(PP2Cαは核内移行したSmad2/3を脱リン酸化させ、それらの核外移行を促進する)。以上の結果から、メトホルミンはBAMBIおよびPPの発現増加を介してTGFβシグナルを抑制し、VICの筋線維芽細胞様変化を抑制する可能性が示唆された。
一方、BMP4の短時間処置により時間および濃度依存的にSmad1/5のリン酸化が亢進し、メトホルミンは濃度依存的にこれを抑制した。メトホルミンはVICにおいて、TGFβのみならずBMPによるシグナル伝達も抑制することを明らかにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度(2年目)は、TGFβまたはBMPによるシグナル伝達およびVICの形質転換に対するメトホルミンの抑制作用について、その詳細なメカニズムの解明を継続する。具体的には、メトホルミンによるTGFβ1誘導性Smad2/3リン酸化およびBMP4誘導性Smad1/5リン酸化の抑制に及ぼすBAMBI遺伝子ノックダウンまたはPP阻害薬の影響を検討する。加えてBMP4による骨芽細胞マーカー発現、アルカリホスファターゼ活性、カルシウム沈着量の変化に及ぼすメトホルミンの影響を検討する。さらに、BMP4による各変化に対するメトホルミンの作用に及ぼすBAMBI遺伝子ノックダウンまたはPP阻害薬の影響を検討する。
また当初の計画通り、内皮細胞を単離し、TGFβまたはBMPによる内皮間葉転換に及ぼすメトホルミンの影響を検討する。またVICの実験同様、内皮細胞においてもBAMBIおよびPPのmRNAおよびタンパク質の発現レベルに及ぼすメトホルミンの影響を検討する。メトホルミンがTGFβまたはBMPによる内皮間葉転換を抑制し、かつBAMBIまたはPPの発現レベルを増加させる場合、メトホルミンによる内皮間葉転換抑制作用に及ぼすBAMBI遺伝子ノックダウンまたはPP阻害薬の影響を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定額のほとんどを使用したため、次年度使用額が生じた理由は特にない。翌年度分として請求した助成金と合わせて物品費として使用する。
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