| 研究課題/領域番号 |
20K15687
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
|---|
研究代表者 |
安藤 清彦 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門, 主任研究員 (70806752)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | ウシ白血病 / miRNA / レポーターアッセイ |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は、ウシ白血病ウイルス（BLV）にコードされるマイクロRNA（miRNA）が後から細胞に侵入するBLVの重複感染を阻害し得るか検証するものである。今年度は、実験に用いる遺伝子組換えBLVとmiRNA発現プラスミドを構築した。
１細胞単位で複数のウイルスの重複感染状況を観察するため、BLV遺伝子に緑色及び赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ２種類のBLV感染性クローンを作出した。作出した感染性クローンを導入した293T細胞は、BLV envタンパク質感受性細胞と共培養することでenvタンパク質による膜融合によりシンシチウムを形成し、シンシチウム中に蛍光タンパク質を発現することが確認された。当初計画では本感染性クローンをウシ由来B細胞株に導入することで組換えBLV感染B細胞を作出する予定であったが、使用予定であったBLV非感染ウシ由来B細胞株が販売中止となっていたため実験目的に適した細胞を入手することができず、持続感染細胞の樹立には至らなかった。
また、BLVがコードする5種類のmiRNA（miR-B1~5）をそれぞれ単独で発現する発現プラスミドを構築し、miR-B1、2、4、5の４種類についてmiRNAの標的配列を付加したレポータータンパク質に対する翻訳抑制活性を確認した。miR-B3については、発現プラスミドは構築できたもののmiRNAによる抑制活性が認められず、もともと活性を持たないmiRNAなのか、それとも本実験系で検出できないほど活性が微弱なのか判断することができなかった。構築したmiRNA発現プラスミドを培養細胞に導入して持続発現細胞の樹立を試みたが、樹立された持続発現細胞は一過性発現細胞と比較してmiRNAによる抑制活性が低くなる傾向が認められたため、以降の実験には一過性発現細胞を用いることとした。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画では、初年度にレポーター遺伝子搭載BLVの作出とmiRNA発現細胞構築を行い、２年目以降にそれらの材料を用いた解析を実施する予定であった。BLV非感染ウシB細胞株の販売中止や持続発現細胞におけるmiRNA活性低下等の理由により組換えBLV持続感染細胞やmiRNA持続発現細胞を樹立することはできなかったが、おおむね計画通り実験材料の準備が進んでいると考えられる。
しかしながら、予定していた細胞株が手に入らず組換えBLV持続感染細胞を樹立することができなかったため、当初計画していた実験を実施できなくなってしまったことは想定外であり、持続感染細胞を準備するための別の手段を採用するか、あるいは感染細胞を用いない解析方法を構築する必要が生じた。そのため、当初計画にはない実験を追加する必要があるが、次年度内で対応可能と考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
感染性クローンをBLVフリーのウシB細胞株に導入する手法が使用できなくなったため、すでにBLVに感染しているB細胞株を活用するための方法を検討する。また、バックアップとして、感染細胞を用いない実験系の構築を試みる。具体的には、構築したmiRNA発現プラスミドを導入した培養細胞にcell free BLVを感染させてmiRNAによる干渉現象を観察するため、BLV感染に反応するレポーター発現プラスミドを構築してBLV感染を定量化可能なレポーターアッセイ系を構築する。
本来、BLVは感染B細胞からcell-to-cell様式で新たな細胞へと感染するため、B細胞以外の細胞株やcell freeウイルスを用いる実験系はin vivoにおけるBLVの感染動態を正確に反映しない恐れがあるが、まずはmiRNAがBLV感染初期の転写複製に対して干渉するか否かを解明することを目的として実験を継続する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画よりも順調に組換えウイルスや発現プラスミドの構築が完了したため、次年度使用額として繰越を行った。繰越分は追加で必用となった実験系構築に使用する予定である。
|
