| 研究課題/領域番号 |
20K15700
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
守田 昂太郎 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (80826545)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 胚性ゲノム活性化 / ラット / ラット / エピゲノム |
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| 研究実績の概要 |
昨年度の計画は、ラットとヒト胚に共通した転写因子やマウスには存在しないエピゲノム修飾のパターンを明らかにすることであった。これまでの報告から、受精後の初期胚でヒトとマウスで異なる転写因子が明らかにされているが、現在までラット胚をRT-PCRで調べる限り、マウス胚には存在せず、ヒト胚と共通して発現している転写因子は見つかっていない。しかしながら、様々なエピゲノム修飾を免疫染色で調べる過程で、H3K27acが受精卵と2細胞期ではっきりと検出されるのに対して、未受精卵や8細胞期ではほとんど検出されなくなることを明らかにした。マウスの場合、H3K27acは2細胞期ですでにほとんど検出されなくなるため、マウスにはないエピゲノム修飾の動態であることが示された。この修飾はヒストンシャペロンとして機能するBETファミリータンパク質によって除去され、RNA Pol IIの転写活性に関与していることが知られているため、申請者はBETファミリータンパク質に焦点を当てた。BETファミリータンパク質の阻害剤を用いてラット受精卵を培養した結果、胚発生は2細胞期で停止したことから、BETファミリータンパク質が初期胚発生の2細胞期以降の発生に重要な遺伝子発現の制御に関与している可能性が示唆された。計画では、CRISPR/Cas9によるエピゲノム修飾酵素のノックアウトを予定していたが、受精時から非常に検出レベルが高かったので、阻害剤に加え、siRNAによるノックダウン法を用いてBETファミリーの中で重要なタンパク質を明らかにすることを計画している。最終的には、BETファミリータンパク質の結合のタイミングを決めるための機構が種によって異なるのかどうかを明らかにし、ZGAとの関係を調べる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請時では、新規合成されたRNAの観察により、ラット初期胚における転写活性化(ZGA)時期はマウスとは異なり、ヒトに近いタイミングで生じていることを明らかにしていた。このZGAの開始のタイミングが異なる機構を調べるために、これまでの報告をもとに、マウスとヒトの初期胚で異なる転写因子について調べたが、現段階では、マウスには存在せず、ラットとヒトと共通した転写因子は発見できてはいない。そこで、転写制御に関与しているH3K4me3、H3K9me3、H3K27me3、H3K27acのエピジェネティック修飾を調べた結果、胚性ゲノムの活性化時期に対応して、H3K27acがダイナミックに減少し、ZGAが起こるとされる8-cellではほとんど検出されないことが明らかになった。H3K27acは転写活性として知られているが、転写が始まると転写領域から消失することが明らかになっている。そのため、H3K27acの減少が胚性ゲノムの活性化に重要である可能性が示唆された。実際に、最近の報告によると、ゼブラフィッシュのH3K27acの動態をライブセルイメージングによって調べた結果、ゲノムの活性化時期に相関してH3K27acが消失することが明らかにされている(Sato et al., Development, 2019)。H3K27acはBETファミリータンパク質によって取り除かれ、RNA Pol IIの転写が可能になるため、次に申請者はBETファミリーに着目し、阻害剤のJQ-1でラット受精卵を培養した。その結果、ほとんどの胚の発生は2細胞期で停止した。このことから、ラットのBETファミリーは2細胞期において細胞分裂に関連している遺伝子の発現を抑制することが示唆された。以上の結果から、ZGA開始にはBETファミリータンパク質によるH3K27acの除去のタイミングが関与している可能性が示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度の研究により、BETファミリータンパク質の阻害によって胚発生が2細胞期で停止することを明らかにした。今後は、BETファミリータンパク質がZGAに関与しているかどうか阻害剤JQ-1を用いて明らかにし、BETファミリーの結合のタイミングがZGAの開始に関与しているかどうかを明らかにする。次に、なぜマウスとラットでBETファミリーの結合のタイミングが異なるのかを明らかにするために、BETファミリーを構成するタンパク質の塩基配列について調べ、生物種によって機能が変わる領域が存在するかどうかを明らかにする。また、ラットの体細胞（卵丘細胞等）をマウス胚へ移植することにより、ZGAの時期を早めることが可能かどうかを調べる。反対に、マウスの体細胞をラット胚へ移植することにより、ZGAが遅くなるのかどうかを明らかにする。また、H3K27acが制御する領域はZGAで発現する領域かどうかを明らかにするために、RNA Pol II阻害剤の処理胚と、BETファミリーの阻害剤の処理胚、未処理胚を用いてRNA-seqを行い、発現している遺伝子の比較を行う。RNA Pol II阻害剤とBETファミリー阻害剤処理区で処理された胚で抑制されている転写産物がどの程度一致しているかを調べ、ZGAにどの程度関与しているかを明らかにする。H3K27acによって制御されている転写産物がZGAで発現するものとほとんど一致するようであれば、BETファミリータンパク質の結合のタイミングが種特異的なZGAのタイミングを決めていることを示唆できると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
科研費申請時には令和2年度は少なくとも4つの学会へ参加することを計画し、旅費から旅費を支払うことを予定していた。しかし、新型コロナウイルスの感染拡大により、出張はなくなり、オンラインでの参加へ変更した。そのため、旅費の分の額が余り、次年度学が生じた。
令和3年度もオンライン開催の学会が多く、出張へ行かないため、実験等の物品購入費に充てる予定。
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