| 研究課題/領域番号 |
20K15702
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
中村 和臣 鳥取大学, 医学部, 特命助教 (90598137)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ラット着床前胚 / アポトーシス / ミトコンドリア |
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| 研究実績の概要 |
実験動物のラットの初期胚（着床前胚）は、体外培養すると、着床後の出生率が著しく低下する。この出生率低下を引き起こす要因として、ミトコンドリアの働き（異常）に着目をしている。
ラット初期胚におけるATP濃度を可視化し、体内発生胚と体外発生胚におけるエネルギー産生の違いを解析するために、FRETを利用したATP indicatorラットを作製したい。これは、ミトコンドリアの活性を可視化することが目的である。令和2年度はFRET based ATP indicator (ATeam)を入手し、ニワトリ由来βアクチンハイブリッドプロモーターでATeamがドライブされる発現ベクター(transgene)を作製した。現在、このtransgeneを導入したラットを作製中である。
ラット初期胚におけるアポトーシスの引き金となるミトコンドリア膜透過性遷移を検出し、ミトコンドリア依存性アポトーシスの関与を探りたい。ミトコンドリア膜透過性遷移を検出するプローブを用いてラット胚盤胞の染色を試みたが、内部細胞塊（ICM）の染色が困難であった。これは、ICMが栄養外胚葉のタイトジャンクションによって強固に隔離されているため、プローブの浸透が阻害されたためである。現在、immunosurgery法を用いて、栄養外胚葉を破壊してICMを再度染色解析中である。一方、TUNEL染色によりラット初期胚を染色し、そのアポトーシスプロファイルを解析した結果、体内発生胚と体外発生胚との間に、明らかな差があることがわかった。これは、これまでの研究によって明らかにしたラット初期胚における網羅的遺伝子発現解析結果（18K14613の研究成果）と符合する。これに加えて、前述のミトコンドリア依存性アポトーシスとの関連性を探ることで、ラット胚が体外発生した際の発生阻害要因の解明につながるのではないかと期待している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ATP濃度を可視化するためのATP indicatorラット作製に必要な発現ベクターの作製は終了し、現在、ATP indicatorラットを作製中である。これらは、概ね予定通りの進捗である。
ラット初期胚のミトコンドリア膜透過性遷移を検出においては、プローブによる染色が困難であったため、当初より若干予定を変更したが、染色法の改善によって、再トライ中である。ラット初期胚におけるアポトーシスの検出は、想定していたよりも早期に結果が得られたため、次の展開となる実験を早期に実施することを計画したが、新型コロナの影響で、プラスチック製の実験用品が入手困難であったため、次年度に実施することとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
ATP indicatorラット作製、およびラット初期胚におけるミトコンドリア膜透過性遷移解析は、引き続き予定通りに実施する。令和2年度に得られたラット初期胚におけるアポトーシスに関するデータと、科研費：18K14613で得られた網羅的遺伝子発現解析のデータの符合から、アポトーシス関連遺伝子発現について、リアルタイムPCR等を用いて詳細に解析したい。
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