| 研究課題/領域番号 |
20K15716
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
伊藤 将 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (30869061)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 減数分裂組換え / 交叉型組換え / 組換えDNA合成 |
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| 研究実績の概要 |
(1) 減数分裂期における交叉型組換え経路選択の仕組みを明らかにするために、組換えDNA合成に関与することが想定される遺伝子のノックアウトマウスを作成し、表現型の解析を行なった。その結果、オスマウスは不妊となり、精巣の萎縮が観察された。減数分裂期の細胞について免疫染色法により詳細な検証を行なった結果、減数分裂組換えの開始過程であるDNA二本鎖切断（DSB）は野生型と同程度に形成される一方で、DSB修復に必須なRAD51リコンビナーゼのfoci数の上昇や、相同染色体間の対合の異常が観察された。この結果から、減数分裂期の組換えDNA合成が適切なDSB修復及び相同染色体間の対合に必須であることが示唆された。さらに、DSB修復への影響をゲノムワイドに検証するために、RAD51及びDMC1リコンビナーゼに対するChIP-seq (SSDS; Single-stranded DNA sequenicing) を実施し、現在得られたデータの解析を行なっている。予備解析の結果、RAD51に比べてDMC1のシグナルが強くなかったため、現在成熟したオスマウスに加えて、出生後12日前後のマウスを用いての検証を進めている。
(2) 組換えDNA合成のゲノムワイドなマッピングのコントロールとして上記変異体を用いるために、野生型と合わせて変異体の精細胞についても、BSA gradient法を用いて成熟したオスマウスの精細胞を分画を試みた。その結果、野生型は目的のステージの細胞を80-90%以上の純度で分画・抽出できる一方で、変異体の細胞については野生型と同一条件では分画が効率良く行えなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
RAD51及びDMC1リコンビナーゼに対するChIP-seq (SSDS; Single-stranded DNA sequenicing) を実施する際にNova-seqを利用したところ、クラスター形成がうまくいかず、充分なリードを稼ぐことができなかった。先進ゲノム支援の先生からHi-seqでの実施を提案頂いたため、Hi-seqで実施したところ、クラスターが問題なく形成され、充分なリードを稼ぐことができた。上述のトライ&エラーに加えて、シークエンスで必要な試薬の納期の遅れも重なり、進捗の遅延が生じている。また、ゲノムワイドな組換えDNA合成のマッピングと比較するために、交叉型組換え経路選択の指標となるタンパク質のChIP-seqを実施したが、顕著なピークが検出されたなかった。現在、条件検討を行なっており、こちらも進捗の遅れの一因となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述の組換えDNA合成への関与が示唆された遺伝子のノックアウトマウスの解析を進める。具体的には、RAD51以外の組換えタンパク質の局在や、PCNA, RFCといった組換えDNA合成への関与が示唆されるタンパク質の局在を免疫染色により調べ、組換えDNA合成が破綻した場合に減数分裂組換えにどのような異常が生じるのかを明確にする。また、昨年度に引き続きゲノムワイドな組換えDNA合成のマッピングの検討を進め、上述のノックアウトマウスをネガティブコントロールとして使用することで、より確実な組換えDNAマッピング法の確立を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ChIP-seqやSSDS等のゲノムワイド解析の進捗に遅れが生じたため、一部の必要物品を当初の計画通りに購入しなかった。本年度は必要物品の納期の遅れも考慮し、研究の進捗に合わせ必要物品を早めに購入することを計画している。
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