| 研究課題/領域番号 |
20K15716
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
伊藤 将 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (30869061)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 減数分裂組換え / 交叉型組換え / 組換えDNA合成 |
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| 研究実績の概要 |
減数分裂期における交叉型組換え経路選択の仕組みを明らかにするために、組換えDNA合成に関与することが想定されるタンパク質の抗体を作製し、免疫染色により減数分裂期の細胞における局在を検証した。その結果、相同染色体が対合する領域に特異的に局在が観察された。これは、組換えDNA合成と相同染色体間の対合が関連するという、目的遺伝子のノックアウトマウスの解析から得られた結果と一致する。
また、減数分裂組換えにおける組換えDNA合成を多角的に検証するために、阻害剤を加えて減数分裂期の細胞をex vivoで培養し、解析を行った。その結果、DSB修復の遅延、及び、交叉型組換え部位に結合するMLH1のfoci数の減少が見られた。このことは、組換えDNA合成がDSB修復及び交叉型組換えの形成に極めて重要であることを示唆する。
昨年度実施したRAD51リコンビナーゼに対するChIP-seq (SSDS; Single-stranded DNA sequenicing) データを解析した結果、先行研究と比較して減数分裂組換えホットスポット以外への弱い結合が多く検出されたが、強い組換えホットスポットに顕著なRAD51の結合が確認された。今後変異体解析などで使用可能な実験系として確立できたと考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
組換えDNA合成に関与することが想定される遺伝子のノックアウトマウスの表現型解析や、目的タンパク質の免疫染色を用いた局在解析は概ね順調に進展しているが、当初計画していたChIP-seqを用いたゲノムワイド解析系の進捗に遅れが生じている。昨年度、RAD51及びDMC1リコンビナーゼに対するChIP-seq (SSDS; Single-stranded DNA sequenicing) を実施した結果、方向性を結論づけるデータは取得できたが、実験ごとのブレやノイズが多く、詳細な解析を行うqualityのデータを得ることができなかった。交叉型組換え経路選択の指標となるタンパク質のChIP-seqについても現在条件検討の途中であり、この点については進捗がやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度明らかになった、組換えDNA合成に関与することが想定されるタンパク質の局在について、他の組換え制御因子との共局在や、相同染色体間の対合領域における局在の詳細を、高解像度顕微鏡を用いて解析する。また、阻害剤添加による組換えDNA合成と減数分裂組換えの解析についても、阻害剤の添加時期や濃度を変更し、組換えDNA合成がDSB修復及び交叉型組換えの形成において果たす役割を詳細に明らかにする。ゲノムワイド解析については、ChIP-seqに加えてCUT&RUNの条件検討に着手し、qualityの高いデータの取得を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ChIP-seq等のゲノムワイド解析の進捗に遅れが生じたため、一部の必要物品を当初の計画通りに購入しなかった。本年度は最終年度のため、研究の進捗に合わせ必要物品を早めに購入することを計画している。
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