| 研究課題/領域番号 |
20K15721
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| 研究機関 | 愛知県がんセンター(研究所) |
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研究代表者 |
上原 了 愛知県がんセンター(研究所), 腫瘍制御学分野, 研究員 (70842590)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | R-loop / RNase H2 / 自己免疫応答 / ゲノム不安定性 / 転写 |
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| 研究実績の概要 |
R-loopは転写されたRNAが二本鎖DNAに侵入して形成する三本鎖構造で、ゲノム上に普遍的に存在し、遺伝子発現の制御を担っている。一方で、その分解が滞ると複製ストレスやゲノム不安定性を増大させ、自己免疫疾患やがんといった疾患の原因になると考えられている。本研究はR-loopの代謝制御が破綻することで引き起こされる現象の解明が目的である。R-loopの主要な分解酵素であるリボヌクレアーゼH2（RNase H2）は、R-loopに対する活性とは別にDNAポリメラーゼが取り込んだ単一リボヌクレオチド（rNMP）をDNAから除去する活性を持つ。RNase H2の遺伝子ノックアウトにより両方の活性が同時に失われると、rNMPの過剰な蓄積によるDNA損傷応答が起こる。２種類の基質の蓄積による現象を区別するため、RNase H2の立体構造からR-loopとの相互作用に重要なアミノ酸を予測し、rNMPへの活性を維持しながらR-loop分解活性を失った変異体を設計した。この変異酵素を大腸菌で発現・精製し、モデル基質を用いてR-loop分解活性が特異的に消失したことを確認した。次にHEK293細胞の遺伝子上にCRISPR-Cas9を用いて点変異導入を行い、上記のRNase H2変異体のホモ接合体・ヘテロ接合体のクローンをそれぞれ樹立することに成功した。今後、これらの細胞においてR-loopの蓄積量と局在、遺伝子発現のパターンを解析する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は異動に伴い環境が変化したため、研究準備に時間を多く費やした。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究対象となる細胞株の樹立に成功したため、その表現型の解析を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
目的変異を持った細胞株樹立に時間を費やしたため、解析まで至らず本年度予算の半分程度を繰り越した。次年度に予定している次世代シーケンサーによる解析に費用が掛かるため、繰り越し金を解析費用に充てる予定である。
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