| 研究課題/領域番号 |
20K15732
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
竹川 宜宏 大阪大学, 理学研究科, 助教 (50791810)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ストマチン / チャネル / 細菌 / べん毛 / 線虫 / 蛋白質間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
細胞や細胞内小器官の膜中には、チャネルやトランスポーターなどの膜タンパク質が存在し、膜を介したイオンや水溶性物質の移動を担う。ストマチン様タンパク質(stomatin-like protein、以下slipin)は様々なチャネル/トランスポーターの活性制御に関連するタンパク質ファミリーの一種であり、真核生物から原核生物まで共通して保存されている。本研究では、slipinおよび、それが制御するチャネルタンパク質に着目し、それらの相互作用機構を構造学的手法により明らかにすることを目的とする。slipinは同一のファミリーに属しながら、多岐に及ぶ膜タンパク質と相互作用する。本研究では線虫と細菌の2種の生物をモデルとして、線虫の神経のslipin(MEC-2)とNa+チャネル(MEC-4)あるいはギャップ結合チャネル(INX-4)、細菌のべん毛のslipin(FliL)とH+/Na+チャネル(MotA/B)に着目し、それらの複合体構造をX線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡観察により明らかにし、相互作用機構を分子構造の知見から考察することを目的とした。本年度は、MEC-4の発現・精製系を確立し、精製MEC-4が多量体を形成することを明らかにした。また、精製MEC-2との相互作用解析に必要な準備を整えた。好熱性細菌Aquifex aeolicusのMotAや海洋性細菌Vibrio alginolyticusのMotA/BホモログであるPomA/Bの精製を行い、低温電子顕微鏡による近原子分解能での構造決定に成功した。枯草菌Bacillus subtilisのMotBホモログであるMotSがNa+/K+依存的にその構造を変化させることを明らかにし、その際イオンを認識する2つの荷電残基を証明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度は新型コロナウイルスの影響により、実験進行のための十分な人員および時間を割くことが難しかったため、昨年度の段階で既に研究課題の全体の進捗状況が遅れていた。本年度はそういった新型コロナウイルスによる問題は緩和状況にあり、本年度の研究としては順調に進行したが、昨年度の遅れを取り戻すことはできなかった。研究の方向性としては概ね想定通りの方向に進んでおり、研究そのものには問題は生じていないことを補足する。
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| 今後の研究の推進方策 |
FliLとMotA/Bの複合体、MEC-2とMEC-4の複合体、MEC-2とINX-4の複合体の構造を、X線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)を用いた解析により明らかにする。全長タンパク質の構造解析を目指すが、同時に、より難易度の低い、推定相互作用ドメインの複合体構造を明らかにすることも目指す。FliLとMotA/Bの複合体に関してはその詳細な相互作用部位が生理学・生化学的手法により明らかになりつつあるため、部位特異的に架橋を行うことで複合体形成の促進・安定化を行うことで効率的に複合体としての構造解析を行う。MEC-2とMEC-4の複合体に関しては安定的な相互作用解析の下準備が完了したため、今後は複合体の精製を積極的に行う。得られたslipin-チャネル複合体の構造とチャネル単独での構造を比較することで、slipinがチャネルのどこに相互作用することで、どのように構造が変化し、その結果どのようにチャネルの機能が制御されているかを明らかにする。全長構造ではなく複合体の部分構造のみが明らかになった場合も、チャネルの単独構造との比較・当てはめを行い、in silicoで再ドッキング・分子動力学的解析を行うことで、slipinの結合によるチャネルの構造変化を明らかにする。
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