バクテリアべん毛蛋白質輸送装置のゲート開閉機構の解明

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K15749
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 木下 実紀 大阪大学, 生命機能研究科, 特任研究員(常勤) (30790985)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 細菌 / 電子顕微鏡 / 蛋白質 / 遺伝学 / 感染症

研究実績の概要

本研究では、輸送ゲートの開閉機構およびエネルギー変換機構を原子レベルで解明するため、最も本質的な部分を担う輸送ゲート蛋白質FlhAおよびFlhBに焦点を合わせ、遺伝学・生化学的機能解析、X線結晶構造解析およびクライオ電子顕微鏡による構造解析を実施する。本年度の主な成果は以下に示す。
1.べん毛蛋白質輸送チャネルが膜電位依存的に活性化されることを突き止めるとともに、輸送ゲート蛋白質FlhAと ATPase複合体のサブユニットの一つである FliJとの相互作用が膜電位依存的に安定化されることが示唆された。さらに、膜電位の増加に伴って輸送活性を示す flhA変異体から膜電位依存性が顕著に低下した変異株を多数単離した。現在、その変異箇所を同定中である。
2.輸送ゲート変異体の解析から、FliP、FliQ、FliRからなる輸送チャネルの細胞質側の入口ゲートが開くと、それと連動してFlhAのイオンチャネルが開くこと、さらに輸送チャネル側に大きく張り出しているFliRのプラグループが大きく構造変化することが示唆された。このような連動した構造変化により、イオンの内向きの流れに共役して輸送基質タンパク質が細胞外方向にのみ移動できることが推察された。
3.輸送ゲート複合体を含む MSリング複合体の精製に成功するとともに、クライオ電子顕微鏡により Mリング部分の高解像度の電子密度マップを所得することに成功した。現在、 Mリング部分の原子モデルを構築中である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

変異体解析から、輸送ゲート複合体のゲート開閉機構およびエネルギー変換機構の概要をつかむことができた。クライオ電子顕微鏡により輸送ゲート複合体を収容するMSリングの高分解能構造解析に成功した。

今後の研究の推進方策

膜電位依存性が低下した変異株の機能解析を進めるとともに、輸送ゲート複合体のクライオ電子顕微鏡像を数万から数十万を収集し、できるだけ原子分解能に近い構造情報の取得を目指す。

研究成果

• [国際共同研究] ユタ大学(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: ユタ大学
• [国際共同研究] 南京農業大学(中国)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: 南京農業大学
• [雑誌論文] A positive charge region of Salmonella FliI is required for ATPase formation and efficient flagellar protein export (2021)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita Miki、Namba Keiichi、Minamino Tohru
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 ページ: 464
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01980-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Two distinct conformations in 34 FliF subunits generate three different symmetries within the flagellar MS-ring (2021)
  • 著者名/発表者名: Takekawa N, Kawamoto A, Sakuma M, Kato T, Kojima S, Kinoshita M, Minamino T, Namba K, Homma M, Imada K.
  • 雑誌名: mBio 巻: 12 ページ: e03199-20
  • DOI: 10.1128/mBio.03199-20
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The FlgN chaperone activates the Na+-driven engine of the Salmonella flagellar protein export apparatus (2021)
  • 著者名/発表者名: Minamino T, Kinoshita M, Morimoto YV, Namba K.
  • 雑誌名: Commun. Biol. 巻: 4 ページ: 335
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01865-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The homologous components of flagellar type III protein apparatus have acquired a novel function to control twitching motility in a non-flagellated biocontrol bacterium (2020)
  • 著者名/発表者名: Fulano AM, Shen D, Kinoshita M, Chou SH, Qian G.
  • 雑誌名: Biomolecules 巻: 10 ページ: 733
  • DOI: 10.3390/biom10050733
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Molecular organization and assembly of the export apparatus of flagellar type III secretion systems (2020)
  • 著者名/発表者名: Minamino T, Kawamoto A, Kinoshita M, Namba K.
  • 雑誌名: Curr. Top. Microbiol. Immunol. 巻: 427 ページ: 91-107
  • DOI: 10.1007/82_2019_170
  • 査読あり
• [学会発表] Gating mechanism of the bacterial flagellar protein export engine (バクテリアべん毛蛋白質輸送エンジンのゲート開閉機構) (2020)
  • 著者名/発表者名: Kinoshita M, Miyata T, Kato T, Namba K, Minamino T.
  • 学会等名: 第58回日本生物物理学会年会
  • 招待講演
• [備考]
  • URL: https://www.fbs.osaka-u.ac.jp/ja/research_group/detail/24