|
細胞内における液－液相分離は、液滴等の凝集体形成によって、効率的な生化学反応やタンパク質複合体の形成等の多様な生体機構に関与している。本研究では、人工的に相分離を誘導する簡便な系を確立し、これまで計測困難であった生細胞内における相分離過程の物理化学的性質を、１分子イメージングにより定量解析することを目的とした。本年度は、前年度までに構築した相分離誘導系を用いて、誘導液滴内の１分子動態の定量解析及び、相分離形成能に関与するアミノ酸構成の探索を行った。FUSタンパク質のN末端天然変性領域(IDR)にFKBPとSNAPタグを融合したタンパク質と、mAzamiGreenを融合したFRBによる足場タンパク質を、U2OS細胞で発現させ、誘導した液滴およびIDR１分子動態を同時撮影した。微小な液滴領域内における１分子動態を解析するために蛍光画像処理および軌跡抽出法を確立した。本解析法を応用することで、微細な転写領域内における転写関連タンパク質の１分子動態定量に成功した。また、液滴内の１分子軌跡から液滴の粘弾性を精密に測定することが可能になり、核小体の粘性係数を細胞内で初めて推定し報告した。構成アミノ酸の相分離能への寄与を調べるためにTAF15のIDRにおける変異体解析を行った。遺伝子全合成によりIDR内の33アミノ酸をランダムに置換したところ、同familiyタンパク質と同様のアミノ酸組成において液滴形成能を維持したことから、アミノ酸組成の液滴形成における重要性が示唆された。現在これら変異体を用いた精密な1分子動態解析を行っており、誘導系構築法と合わせて成果をまとめている。
|
