| 研究課題/領域番号 |
20K15766
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
篠原 雄太 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (10755193)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 概日時計 / 温度補償性 / 多重リン酸化 / 脱リン酸化 / casein kinase 1 / 蛋白質間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
単細胞生物から哺乳類に至るまで多くの生物種において、正確な周期性(１日約２４時間)と頑強な温度補償性を維持する概日時計がシステムとして備わっている。本研究では、哺乳類概日時計の周期長を決めているリン酸化酵素CKIに、内在的に備わっている脱リン酸化活性が時計タンパク質の多重リン酸化制御に働く仮説を基に概日時計における脱リン酸化活性の生物学的な意義、活性の制御機構の解明を目的としている。
１．時計タンパク質由来のリン酸化ペプチドを化学合成し、ADP依存的な脱リン酸化活性を最も高める時計タンパク質の基質領域を同定した。さらに同定した基質領域にアスパラギン酸やグルタミン酸変異を導入した基質ペプチドにおいて、脱リン酸化活性を制御できることを見出している。
２．酵素側のリン酸化基質の認識領域を特定するために、結晶構造解析からSO3イオンなどのネガティブチャージを有する分子が結合しているアミノ酸領域を中心にCKI変異型の作製を行った。その結果、CKIがリン酸化基質を認識しているドメインを結晶構造より明らかにし、実際に脱リン酸化活性を失活させたCKI変異型の作製に成功した。ミカエリスメンテン解析により、CKI変異型が多重リン酸化反応をさせるとkcat/KmがCKI野生型より高い活性を有していることが明らかになった。これらの１と２の結果により、CKIの脱リン酸化活性の反応メカニズムを基質と酵素側にアミノ酸変異導入で確認を行い、分子レベルで提示することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
時計タンパク質由来のリン酸化ペプチドを化学合成し、CKIの脱リン酸化活性を向上させるリン酸化領域を特定している。またCKIがリン酸化ペプチドを認識しているアミノ酸ドメインを、構造解析から推測しCKI変異型を作製しており、in vivoで検証できるデータが揃っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、マウス個体においてin vitroで得られた変異体情報を実証して、概日リズムにおけるCKIの脱リン酸化活性の役割を示していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
タンパク精製で使用するカラムなどの納期が新型コロナの影響により遅れてしまい、実験が予定通りに行うことができなかった。そのため次年度に発注をして差額分を使用する
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