| 研究課題/領域番号 |
20K15766
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
篠原 雄太 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 特任講師 (10755193)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 概日時計 / 多重リン酸化 / 脱リン酸化 / casein kinase 1 / クリプトクロム / 温度補償性 / タンパク質間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は概日時計の周期を決定しているCKIδの脱リン酸化活性に着目し、多段階なリン酸化が1日24時間の正確性を示す分子メカニズムの解明を目的としている。時計タンパク質由来のペプチドライブラリーからCKIδの脱リン酸化基質をセレクション可能な評価系を構築し、脱リン酸化活性が向上するペプチドや基質として認識しないペプチドを発見した。さらにCKIδの脱リン酸化活性部位を結晶構造を基にリン酸化認識部位を推測して、点変異体を導入して、CKIδの脱リン酸化活性部位を同定しており、CKIδの脱リン酸化機構の分子レベルでの理解は、予定通りに順調に進捗している。
またCKIδの脱リン酸化機構の解明をしていく過程で、新たな時計タンパク質にも強い酵素活性を有することを見出した。この時計タンパク質の酵素反応は概日リズムの多段階なリン酸化に関与している可能性が示唆された。1日24時間の時間スケールの遅い多段階なリン酸化を担う仕組みがCKIδの脱リン酸化か新たな時計タンパク質の酵素反応かをマウス個体で明らかにしていく。時計タンパク質のノックアウトマウスにアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いて、レスキュー系を構築した。in vitroで見出した脱リン酸化活性が著しく弱い変異型では、リン酸化活性が優位に働くため、短周期の表現型が予想されるが、構築したレスキュー系で評価すると短周期型の表現型を有しており、脱リン酸化反応は概日リズムの多段階なリン酸化に関与している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
CKIδの脱リン酸化活性を示す基質の探索は予定通り行っている。またCKIδの脱リン酸化活性部位もCKIδに点変異を導入して活性の評価が終了し活性部位が明らかになってきた。
一方で、CKIδの機能探索の結果から、新たな時計タンパク質にも脱リン酸化機能があることが明らかになってきた。今後、概日リズムを制御している酵素機能としてどのような脱リン酸化活性が一日24時間の周期を保持するのかをin vitroでの機能解析とin vivoのマウス表現型から明らかにしていく予定である。in vivoのマウス表現型に関してはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いて、時計遺伝子ノックアウトマウスに遺伝子導入するレスキュー系を構築してきた。今後はタンパク質レベルで発見してきた時計タンパク質の点変異を、マウスのレスキュー系で評価をしていく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
【1.CKIδの脱リン酸化基質領域の探索】初年度に完了した。
【2.CKIδの脱リン酸化活性部位の探索】点変異スクリーニングにより、CKIδの脱リン酸化活性部位を発見した。今後はAAVベクターを用いてマウスの表現型を評価していく。
【3.概日リズムにおける脱リン酸化反応の意義】CKIδの脱リン酸化機能探索を行った過程で別の時計タンパク質にも脱リン酸化機能があることを発見した。今後はどの時計タンパク質が概日リズムに核心的に影響を及ぼし、生理学的な機能を個体レベルで表現されるかを評価していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
一部のマルチプレートなどの実験消耗品が新型コロナウイルスの影響を受けて、全国的に納期未定になる遅れが生じた。このため、予定していた発注を取りやめたため、当該助成金の使用額に差が生じた。また酵素反応を測定しているEZリーダーのチップが材料不足で、納期が大幅に遅れたため発注を取りやめした。
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