| 研究課題/領域番号 |
20K15777
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
弘澤 萌 京都大学, iPS細胞研究所, 特定研究員 (10849566)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
|
| キーワード | CRISPR-Cas / Anti-CRISPR protein |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究では、抗CRISPRタンパク質（Acr）を Casタンパク質に対するリクルーターとして再構築し、Acrを新規ゲノム編集のツールとすることを目指している。
本年度は塩基編集が可能であるかどうかを検証した。塩基編集を簡便に確認するために、塩基編集が起こるとGFPがBFPに変換される系を利用した。具体的には、GFPがゲノム上に組み込まれたiPS細胞を利用した。つまり、塩基編集が起こるとGFPがBFPに変換されるので、この変化をFACSにより解析し塩基編集の有無を確認した。
AcrllA5にTadA*（E. coli tRNAアデノシン脱アミノ化酵素の変異体）を融合することで塩基編集が可能かどうかを上記レポーター系により検証した。様々なコンストラクトを作製し検証した結果、効率はかなり低いがBFP陽性細胞の出現を確認した。そこで、このBFP陽性細胞に望みの変異が導入されているかどうかをシーケンスにより検証した。結果、望みの位置に変異（AからGへの変異）を確認することができた。この結果は、AcrllA5にTadA*を融合することで塩基編集が可能であることを示唆している。上記結果は前年に引き続きAcrllA5に任意のタンパク質を融合させることでSpCas9に任意のタンパク質をリクルートできる可能性を支持するものである。
以上より、Acrに任意のタンパク質（ここではTadA*）を融合させることでAcrを介した塩基編集が可能であることを実証し、Acrを介した機能制御の範囲を拡大することに成功した。ゲノム編集ツールの拡張は本分野において重要であり、本成果もそれに貢献できているのではないかと思われる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、AcrllA5に任意のタンパク質を融合させることで塩基編集が可能かどうかを検証した。そこでAcrllA5にE. coli tRNAアデノシン脱アミノ化酵素の変異体であるTadA*を融合させた (AcrllA5-TadA*)。塩基編集が起こるとGFPがBFPに変換されるレポーター系（ここではGFPをゲノムに組み込んだiPS細胞）を用いた。結果、AcrllA5-TadA*を使用することでGFPからBFPへの変換を確認した。また配列確認を行ったところ、標的配列において所望の変異（AからGへの変異）を確認した。これらの結果は、AcrllA5にTadA*を融合することで塩基編集が可能であることを示唆している。
AcrllA5の機能拡張（塩基編集）が可能であることを実証したことより、現在までの進捗状況としては「おおむね順調に進展している」とした。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、Acrによる新規ゲノム編集法をproof of conceptとして論文にまとめる。そのために、これまでに実証したことを補完する実験が必要であれば行っていく。また、再現性の確認を再度行う。加えて、可能であればこれまでに作製したコンストラクトを改善できないかを検討する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本来であれば、実験関連や学会関連等で使用する予定であった。しかしながら、昨年に引き続くコロナウイルスの影響や、本研究以外の研究等に時間を割いたのも一因となり当該助成金が生じた。
使用計画としては、助成金を物品費（細胞培養関連、研究関連書籍等）、学会参加費、その他（研究成果発表費）に大きく割り振る事を考えている。
|
