| 研究課題/領域番号 |
20K15799
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
田島 達也 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 助教 (80845058)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 線虫 / 精子 / アルギニンメチル化 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質アルギニン残基（Arg）のメチル化は、PRMTファミリー呼ばれるメチル基転移酵素により触媒され、モノメチルアルギニン化（MMA化）を経て、非対称性ジメチルアルギニン化（ADMA化）または対称性ジメチルアルギニン化（SDMA化）される。これまでのin vitroメチル化実験から、ADMA化酵素であるPRMT-1は精子特異的かつ哺乳類プロタミン代替タンパク質されているSPCH-2およびSPCH-3の43位Argをメチル化することを明らかにした。また、遺伝学的なアプローチより、SPCH-2は線虫の生殖機能に大きく寄与しており、精細胞形成と精子形成の偽足（哺乳類精子のべん毛に相当）の伸長に関与している可能性を見出した。
令和4年度は、昨年度の推進方策に記載したSPCH-2は線虫の精細胞形成や精子の偽足の伸長に必要であることから、その原因の解析ついて、精子ミトコンドリアに異常がないか、あるいは精子の運動能について検証した。SPCH-2とSPCH-3の43位Arg のメチル化が線虫の生殖に必要であるかどうかを検証するために、CRISPR/Cas9システムを用いてspch-2/spch-3 R43K 線虫の作製を再度行った。しかし、ポジティブな成果が得られなかった。
最近、MMA化酵素である線虫のPRMT-9は生殖に大きく寄与しており、その原因は精子側にあることが分かった。さらに詳細な解析をしたところprmt-9遺伝子変異体の精子は野生型精子の偽足より短くなり運動能が低下していた。この表現系はspch-2変異体と類似しており、PRMT-9とSPCHタンパク質の関係性を検証している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
これまでの実験より、線虫PRMT-1はSPCH-2とSPCH-3をメチル化した。そこで、配列アライメントからSPCH-1には存在せずSPCH-2とSPCH-3に共通して存在する43位アルギニン（R43）をリジンに置換したところ、PRMT-1によるメチル化が消失したことから、SPCH-2、SPCH-3のR43がアルギニンメチル化部位と特定された。また、spch-1、spch-2、spch-3各変異体を用いた表現型解析の結果、spch-2変異体の産仔数が野生型より顕著に低下しており、その原因は精子形成に異常があることを発見した。しかし、in vitroとin vivoの研究成果と一致する根拠となるデータ得ることができていない。そこで、新たなアプローチとして、PRMT-1以外のArgメチル化酵素がSPCHタンパク質をメチル化するかどうか検証中である。そのため、進捗が当初の予定より大きく遅れている。
令和4年度は、昨年度の推進方策に記載したSPCH-2は線虫の精細胞形成や精子の偽足の伸長に必要であることから、その原因の解析ついて、精子ミトコンドリアに異常がないか、あるいは精子の運動能について検証した。SPCH-2とSPCH-3の43位Arg のメチル化が線虫の生殖に必要であるかどうかを検証するために、CRISPR/Cas9システムを用いてspch-2/spch-3 R43K 線虫の作製を再度行った。しかし、ポジティブな成果が得られなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
最近、当研究室の研究より、線虫PRMT-9 MMA化酵素の活性を持ちかつ、線虫の生殖、特に精子形成に関与していることを発見した。この表現型は、SPCH-2欠失変異体と同様であることから、SPCH-2はPRMT-9によってMMA化されている可能性が考えられた。そこで、大腸菌で発現させた組換えタンパク質を用いて、in vitroメチル化実験で検証する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画通りに研究が進まず、難航している。また、論文投稿費用として予算を残している。
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