| 研究課題/領域番号 |
20K15805
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
巳波 孝至 神戸大学, 理学研究科, 助教 (70834969)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 始原生殖細胞 / クロマチン / 線虫 |
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| 研究実績の概要 |
始原生殖細胞は生殖細胞（精子や卵など）の元となる細胞である。始原生殖細胞は形成後、遺伝情報を保持するために大規模な転写抑制状態が保たれる。特に線虫C. elegansの始原生殖細胞では高密度に凝集した染色体構造が形成される。この転写抑制制御は哺乳類であるマウスではDNAメチル化を主とした制御によって生じるが、線虫ではヒストン修飾依存的な制御によって行われる。よって、線虫始原生殖細胞におけるクロマチン制御の全容を明らかとすることで哺乳類をはじめとした既知の研究とは異なる観点から、始原生殖細胞における遺伝情報を保障するクロマチン制御の種間を通じた性質の理解につなげることが可能であると考えている。
本研究では線虫始原生殖細胞における凝集した染色体構造の形成に必須の因子として、クロモドメイン蛋白質MRG-1に着目した。MRG-1はヒトMRG15蛋白質の線虫ホモログであり、種間で保存されたMRGドメインを介して多様なクロマチン制御因子との相互作用が期待される。本研究では① RNAiスクリーニングをはじめとした解析によりMRG-1と協調して機能するクロマチン制御因子を同定し、その機能解析を進めると共に、② 線虫始原生殖細胞における染色体動態のライブイメージング系を作製し、その経時的な変化を明らかとすることによって、線虫始原生殖細胞における高密度に凝集した染色体構造、その形成に関わるクロマチン制御の理解を深める。令和2年度は主に①を進め、MRG-1と遺伝学的相互作用のあるクロマチン制御因子の同定を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和2年度はRNAiスクリーニングにより、MRG-1と遺伝学的相互作用のあるクロマチン因子の探索を進めた。本解析では体細胞においてmrg-1遺伝子を発現しない変異体を作製し、RNAiによる表現型が野生型と比較して増強、あるいは緩和される遺伝子の同定を試みた。その結果、ヒストンアセチル化酵素CBP-1、ストレス耐性に機能する転写因子DAF-16の機能阻害に働くHCF-1の2つの因子が、MRG-1と協調的に機能するクロマチン制御因子の候補として挙げられた。さらに、DAF-16を阻害するとmrg-1変異体で見られる成長遅延が緩和されたことから、HCF-1、DAF-16からなるストレス応答経路にMRG-1を介したクロマチン制御が関与することが期待される。
さらに、始原生殖細胞特異的にGFPとヒストンH2Bからなる融合蛋白質を発現するトランスジェニック線虫を作製した。今後はこのトランスジェニック線虫株に、性染色体を可視化するコンストラクトを導入することで、常染色体、性染色体の各々の動態を可視化する系を構築する。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度は(1)線虫において既知のクロマチン因子群に対するRNAiスクリーニングを完了し、前年度の解析、並びに新たに候補として挙げられた因子群について、始原生殖細胞特異的に発現するトランスジェニック系統を作製し、MRG-1との相互作用の有無を検証する。さらにこれら因子群の阻害条件下における始原生殖細胞のヒストン修飾状態の変化を網羅的に検証する。次に、(2)LacI-RFP/Lac0システムを利用して、性染色体をレポーター蛋白質により可視化するレポーター系の作製を進める。これにあたり、CRISPR/Cas9システムにより性染色体上にLacO配列を導入する技術を確立する必要がある。また、この技術を利用して(1)で得られたクロマチン制御因子群を任意の遺伝子領域に誘導し、遺伝子発現への影響を検証するなど、(1)、(2)の解析を有機的に結び付けられるよう努める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度の解析では新型コロナの影響による入構制限などから、一部の実験の進捗が遅れた。そのため、当該助成金の次年度使用が必要となった。
まず、クロモドメイン蛋白質MRG-1との相互作用因子の探索を実施するにあたって、線虫の大量培養実験に用いる低温振盪培養機を購入予定であったが、年度内に開始することができなかった。そのため、費用を繰越し、次年度の解析において低温振盪培養機を購入し実験に用いる。次に、RNAiスクリーニングにおいて、線虫の飼育に必要なプラスチックシャーレなどの製品を多量に消費する予定であったが、年度内では予定分の実験を行うことができなかった。RNAiスクリーニングは本年度に続き、次年度も継続して行う予定である。最後に、学会について、中止あるいはオンラインでの実施となったため、出張費として計上していた助成金が未使用となった。繰り越された費用については、次年度以後の学会参加費、あるいはオンライン学会での発表や情報収集を円滑に行うため、PCなどの電子機器の購入に充てる。
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