| 研究課題/領域番号 |
20K15836
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
澁田 未央 (笠松未央) 山形大学, 理学部, 助教 (30849790)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | シロイヌナズナ / 熱記憶 / エピジェネティック修飾 / イメージング / 画像解析 / RNAポリメラーゼ II |
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| 研究実績の概要 |
過度な高温は植物の生育に悪影響を与える。植物は一度高温ストレスを感じるとそれを記憶し、次に同様のストレスを感じた際により効率的に対処することができる、「熱記憶」という仕組みを持つ。「熱記憶」の構築には、DNAの配列変化によらない遺伝子発現制御である、エピジェネティック修飾制御が重要な役割を持つことがわかっている。しかし、その制御過程において、核内で何が起きているか、すなわちエピジェネティック修飾マークの核内分布がどう変化するか、「熱記憶」の構築に関わる遺伝子は核内のどういった位置に配置されるのか、といった核内形態および構造学的な研究は技術的な問題から未だ不十分である。本研究ではモデル植物シロイヌナズナを材料に、蛍光イメージングを主な解析手法とし、エピジェネティック修飾マークのライブイメージングツールやシングルコピー遺伝子の可視化法を取り入れることで、核内転写活性環境フレームワークの構築メカニズムの解明を目指す。
これまでの研究実績として、エピジェネティック修飾マークのライブイメージングツールであるmodification-specific intracellular antibody (mintbody)のシロイヌナズナ植物体への導入に成功し、エピジェネティック修飾レベルの時空間的モニタリングを行い、その成果を学会・論文等で報告した。現在はmintbodyを用いた各種修飾マークの核内ダイナミクスの観察を進めている。また、RNA-seq解析、ChIP-seq解析による高温ストレス前後における遺伝子発現、エピジェネティック修飾レベル変動の一遺伝子レベルでの解析を進めており、「熱記憶」の構築に関わる遺伝子の抽出を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2021年度より山形大学理学部に異動したため、研究室の立ち上げ、および所属機関のイメージング設備とコロナ対策による出張制限から、主にイメージングの分野での進捗が遅れた。一方で、論文執筆や次世代シークエンス解析、既存画像データを用いた画像解析に力を入れ、成果をあげた。
本研究の主要な解析手法である蛍光イメージングのうち、エピジェネティック修飾マークのライブイメージングツールであるmintbodyのシロイヌナズナ植物体への導入に成功し、そのうち、転写の活性化状態を示すエピジェネティック修飾マークであるRNA ポリメラーゼ II のリン酸化修飾を観察できるmintbodyの研究成果をCommunications Biology誌、B&I バイオサイエンスとインダストリー誌に発表した。H3K9ac、H3K4me3、H3K27me3を観察できるmintbodyに関しては、発生・分化プロセスにおけるヒストン修飾ダイナミクスの観察と、誰でも簡単に画像解析を実行できる解析ツールの開発も合わせて行っており、現在Plant Journal誌に投稿準備中である。
RNA-seq解析から、高温ストレス下で特徴的な発現変動パターンを示す遺伝子グループを抽出し、ChIP-seq解析から遺伝子グループに特徴的な因子を検討したところ、高温処理によって即座に転写活性化が生じる遺伝子グループには、処理前の時点で多量のRNAポリメラーゼIIが蓄積している遺伝子が多く含まれることがわかった。この結果から、素早い温度変化に対処するために即座に活性化される遺伝子は、転写因子による制御に加え、RNAポリメラーゼIIの修飾調整による転写ON/OFF制御を受けていることを示唆するものだと考えた。
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| 今後の研究の推進方策 |
一年目に作出したRNA ポリメラーゼ II のリン酸化修飾ダイナミクスを観察できるmintbodyをRNA ポリメラーゼ II のリン酸化修飾変異体に導入し、高温ストレス下におけるRNA ポリメラーゼ II のリン酸化修飾のタイムラプスイメージングを進める。また、各ヒストン修飾を観察できるmintbodyに関しては引き続き検討を進め、順次観察を行う。Mintbodyで観察できない修飾については、並行して固定細胞核を用いた蛍光免疫染色を進め、各エピジェネティック修飾間の相互作用を考察する。これらの観察によって得られた画像をもとに、核内分布パターンを抽出・数値化するための画像解析ツールの確立を目指す。イメージング解析は他機関・他研究室との共同利用ベースで進める。
高温処理によって即座に転写活性化が生じる遺伝子の多くは、処理前の時点で多量のRNAポリメラーゼIIが蓄積している、という解析結果から、RNAポリメラーゼII阻害剤処理やRNAポリメラーゼII修飾酵素変異体などを用いて、高温ストレス前後におけるRNAポリメラーゼII修飾や遺伝子領域分布パターンの変動をRNA-seqおよびChIP-seqなどの次世代シークエンス解析から明らかにし、高温応答および熱記憶の構築におけるRNAポリメラーゼIIダイナミクス、RNAポリメラーゼII修飾の役割を明らかにする。これらの結果とRNAポリメラーゼII修飾の核内分布、「熱記憶」の構築に関わる候補遺伝子の核内配置の観察結果から、核内転写活性環境フレームワークの構築メカニズムを考察する。
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