| 研究課題/領域番号 |
20K15843
|
|---|
| 研究機関 | 山口大学 |
|---|
研究代表者 |
松村 律子 山口大学, 時間学研究所, 助教(特命) (20728216)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| キーワード | 概日時計 / 時計遺伝子 / PERIODタンパク質 / 相互作用 |
|---|
| 研究実績の概要 |
昨年度に引き続き１．PER1とPER3タンパク質の二量体形成に必要なアミノ酸の同定、および２．二量体非形成の培養細胞株樹立と表現型の解析に関する実験を行った。本年度までの研究により、本研究の目的である、PER同士の相互作用が概日時計機構において果たす役割の解明に向けた基礎的なデータの取得と、培養細胞レベルでの研究に適した材料を得ることができた。
昨年度、in vitro実験によりPER3の特定のアミノ酸（X）の変異がPER3とPER1の相互作用に影響することを明らかにした。本年度は、これまでに作成したアミノ酸Xの変異PER3を発現する培養細胞株について、研究目的に適した材料であるかの検証を行った。具体的には、mRNAの塩基配列と発現量の解析、PER1-PER3相互作用などのタンパク質レベルでの検証である。作成した細胞株のうち１系統は、標的のアミノ酸をコードする塩基配列を欠損したPer3を、野生型と遜色ないレベルで発現していた。PER1との相互作用にのみ影響があり、それ以外の機能には大きな影響を与えない変異PER3を発現している可能性が高く、目的に適した細胞株であると考えられる。この細胞株の概日リズムは、野生型と比べて短縮していることも確認された。このことは、PER1-PER3相互作用が概日時計機構において周期決定に関わることを示唆している。タンパク質レベルでの解析は現在進行中であり、ポジティブな結果が得られれば、動物個体での実験へと研究を推進することができる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画では、本年度のうちにPER3変異マウスの作成にとりかかる予定であったが、その段階にまで至らなかったため。原因としては、PER3変異培養細胞株の作成に時間がかかったことが挙げられる。CRISPR/Cas9システムを使ったゲノム編集において、ドナーDNAとの相同組み換えによる変異導入の効率が、非常に低かった。そのため、計画通りの変異株は得られず、計画通りではないが、目的にはかなう変異株の取得へと計画を変更したため、変異細胞株の樹立に時間がかかった。また、PER3タンパク質をウエスタンブロッティングにより検出するための抗体、および培養細胞を用いたin vivoレベルでPER1-PER3相互作用を検出するための共免疫沈降実験に適した抗体がなく、タンパク質レベルでのPER3変異細胞株の解析が進まなかったことも原因として挙げられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
PER3タンパク質の検出に適した抗体の取得に注力する。同時に、培養細胞を使ったin vivoレベルでのPER1-PER3相互作用の検出を、共免疫沈降により試みる。仮に、適した抗体が見つからない場合は、バイオレイヤー干渉法など、共免疫沈降以外での方法を試みる。野生型と比べてPER3変異細胞株では相互作用が弱くなっていることを確認したのち、変異マウスの作成へと進める。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度の研究が想定以上にスムーズに進み、繰越金があったことに加えて、PER3変異培養細胞株の取得に時間を要したために変異マウス作成へと進めず、変異マウス作成に必要なRNAやCas9タンパク質などゲノム編集に必要な試薬の購入などがなかったため。今年度の繰越金は、主として実験試薬などの消耗品購入に使用する予定である。
|
