| 研究課題/領域番号 |
20K15854
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
八木 創太 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 基礎科学特別研究員 (10779820)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | タンパク質進化 / 生命の起源 / フォールディング |
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| 研究実績の概要 |
生命誕生の謎を解き明かす上で、タンパク質の起源の理解は最重要課題の一つである。本研究では、「転写」を司るRNAポリメラーゼを始めとした多くの重要酵素に保存されるβバレルフォールド（DPBB）の初期進化過程の解明を目的としている。特にDPBBが、どの程度まで単純なペプチドで構築できるか？また古代DPBBの機能は何であったのか？を実験的に検証する。これにより、生命の中心的な役割を果たすタンパク質フォールドがどのように誕生し、どのように原始生命システムの生存・進化に寄与してきたかを明らかにする。
約80残基からなるDPBBは内部に２回対称性が見られることから、DPBBは半分の約40残基のペプチドホモダイマーを起源として、遺伝子重複と融合の結果生じたと考えられてきた。そこで、本研究ではこの進化過程を遡り古代DPBBの復元に取り組んだ。始めに、天然より高い内部対称性を持つDPBB配列の探索を行った。この配列を基に理論的設計法及び計算科学的設計により内部に完全な二回対称性を持つDPBB を設計した。さらに、設計した完全内部対称DPBBを半分とした約43残基のペプチドを作成した。このペプチドの結晶構造を解析したところ、ホモダイマー化することでDPBB構造を維持することを見出した。この結果はDPBBが短いダイマー化ペプチドを起源とする仮説を支持する世界初の実験証拠だと言える。
初期タンパク質合成過程において、現在の20種類よりも少ないアミノ酸を利用していたと考えられている。そこで、何種類のアミノ酸でホモダイマー化DPBBを構築できるか検証した。その結果、7種類のアミノ酸からなるDPBBは溶液中ではフォールドしないが、結晶中ではホモダイマーとなりDPBB構造を作ることを見出した。本結果は、タンパク質合成能力が未熟な初期翻訳系であっても、DPBBタンパク質フォールドは誕生していた可能性を示唆する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究では、RNAポリメラーゼを始めとした様々なタンパク質に含まれる汎用的な祖先フォールドDPBBが如何にして誕生し、原始的な生物システムにどのような機能を与えうるかを解明することを目的としている。
2020年度は、自然界において高い内部対称性を持つDPBB配列を同定し、理論的設計法及び計算科学的手法により内部に完全な二回対称性を持つDPBB を13種構築したところ、10種がDPBB構造を維持し、X線結晶構造解析から少なくとも5種は設計通りの完全内部対称DPBB構造を持つことが確認できた。さらに、この完全内部対称DPBBを半分とした43残基のペプチドもホモダイマー化しDPBB構造を維持することを発見した。本結果は、DPBBフォールドが50残基にも満たない短いホモダイマー化ペプチドから誕生したという仮説を裏付ける結果である。
また、このペプチドは13種類のアミノ酸で構成されていることに着目し、より少ないアミノ酸種でDPBBが構築できないかを検討した。その結果、７種類のアミノ酸でもDPBB構造を維持できることが分かった。つまり、短く単純なペプチド（43残基・7アミノ酸種）であってもDPBBフォールドが誕生しうることを実験的に証明できた。またこのペプチドは、2021年度に実施予定の「古代DPBBの機能性探索」を遂行する上で、適切な出発材料となり得る。
さらに、これら研究過程でDPBBの持つ類稀なFolding特性（熱変性後の早いRefolding、乾燥状態からのFoldingなど）、さらに2価金属イオン・低分子リガンド・DNAとの相互作用が確認できた。これらの結果は2021年度に計画している「古代DPBBの機能探索」を遂行する上で実験を円滑にすすめるための重要な基礎情報を供給する。
以上の結果は本計画全体の約3/4の分量に相当する。そのため、当初の計画以上に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに7種類のアミノ酸のみからなるDPBBを構築することに成功してきたが、このペプチドは溶液中ではfoldしないことが分かっている。そのため、この変異体がfoldingできる溶液条件の検討を行う。特に、タンパク質濃度・イオン強度・pH等の溶液条件の最適化実験を行う予定である。また、この変異体は構造安定性を考慮せずに設計を行ったため、配列最適化による安定化の余地が十分にあると予想される。そこで、計算科学的な手法でアミノ酸配列を最適化することで溶液中でもfoldし、高い安定性を持つDPBB構築を目指す。これにより、次の課題である「古代DPBBの機能探索」の実験が円滑に進むと見込んでいる。
これまでの研究から、古代DPBBが持ち得る機能としてリボザイムの安定化や補酵素としての役割が提唱されてきた。しかし、その実験的検証は皆無であるため、古代DPBBの機能性については謎である。そこで、2021年度には復元した古代DPBBもDNAやRNAと相互作用を解析する。予備実験により13種のアミノ酸からなるDPBB変異体はDNAと相互作用することが確認された。そのため、今後、より少ないアミノ酸種から構成されるDPBB変異体も同様の核酸結合特性を持つのか？さらには、結合する核酸の配列特異性があるのか？という問いについて明らかにしていく計画である。また、RNAポリメラーゼリボザイムやRNAリガーゼリボザイム等の種々のリボザイムと混合し、リボザイムの活性や構造安定性に対する影響についても評価する。
以上の実験を通して、古代DPBBタンパク質と核酸との共進化過程を再現し、初期生命進化過程における古代タンパク質の役割を明らかにする計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度は計画していた学会発表などに要する旅費が使用しなかったため、余剰金として発生した。この費用は、2021年度の研究をより効率的に遂行するための物品購入などに充てる計画である。
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