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令和３年度は、病原性糸状菌Aspergillus fumigatusの細胞壁キチン、マンナン、ベータグルカン、ガラクトフラナンの同時蛍光染色手法を整備した。休眠胞子、膨潤胞子、出芽菌糸など A. fumigatus の生育フェーズごとに各種蛍光レクチンで染め分け、多糖由来蛍光強度を同時測定することで、各種細胞壁成分の局在や量の経時的変化の観察を試みた。その結果、3つ以上の異なる波長 (405、488、555、647 nm) にて、ぞれぞれの細胞壁多糖量に応じた蛍光強度を、漏れ込みなく観察することに成功した。染め分けた細胞壁多糖の局在、量を詳細に観察したところ、細胞壁マンナンの蛍光強度は常に菌糸先端が最も高いのに対し、細胞壁キチンは胞子側、分節、分岐起点が高強度であり、測定時間ごとに弱くなったり強くなったり繰り返している様子が観察された。ガラクトフラナンは、菌糸先端の強度は最も伸長が活発な測定点でもっとも高く、より伸長が進むとむしろ強度が減弱する様子が観察された。ここに、抗真菌薬カスポファンギンを処理し、菌糸が凝集した放射状コロニーの細胞壁成分を調べたところ、興味深いことに、細胞壁マンナンが高度に集まる菌糸先端と、ほとんど蛍光が観察されない先端の２種類に分かれることがわかった。同じように、細胞壁キチンを調べたところ、マンナンが集まる菌糸ではキチンの集積が抑制されていることも明らかになった。このように、本研究計画の達成によって、蛍光レクチンとハイコンテントアナライザー、画像解析技術を組み合わせることで、細胞壁多重染色および一斉測定が可能になる未来に一歩近づけたと思われる。
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