| 研究課題/領域番号 |
20K16011
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| 研究機関 | 城西大学 |
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研究代表者 |
茂木 肇 城西大学, 薬学部, 助教 (00582272)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | S-アリル-L-システイン（SAC） / 肝実質細胞 / インスリン様増殖因子１（IGF-1) / Janus kinase 2：JAK2 / 成長ホルモン受容体 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、初代培養肝実質細胞におけるS-アリル-L-システイン（SAC）のインスリン様増殖因子1（IGF-I）分泌およびそのメカニズムについてELISA法および蛍光イメージングにより検討した。SAC刺激後の初代培養肝実質細胞において、細胞内IGF-Iの消失および培養液中IGF-I量の上昇が認められた。培養液中IGF-I量は、SAC刺激後10分で有意に上昇し始め、刺激後20分にはピークに達した。一方、SAC誘発IGF-I分泌作用は、JAK2阻害薬（TG101209）、PLC阻害薬（U-73122）および細胞内Ca2+キレート剤（BAPTA-AM）により抑制された。Western blot法によりタンパク質リン酸化活性を測定したところ、SACがJAK2、PLC、IGF-I受容体チロシンキナーゼ（IGF-I RTK）リン酸化を促進したことが認められた。加えて、SAC誘発PLCおよびIGF-I RTKリン酸化活性は、JAK2阻害薬により有意に抑制されたことから、SACのIGF-I分泌シグナルにおいてJAK2は、PLCやIGF-I RTKの上流に存在することが明らかとなった。また、Ca2+イメージングによりSACが肝実質細胞内のCa2+濃度を上昇させたことも認められた。更に、蛍光イメージングにより、SACがその用量依存して成長ホルモン受容体（GHR）モノクローナル抗体とGHRとの結合を阻害したことが認められた。以上の結果より、SACは、肝実質細胞に存在する成長ホルモン受容体に結合し、JAK2/PLC/Ca2+経路を活性化することによりIGF-Iの分泌を促進することが示された。
上記の検討に加え、リアルタイムPCR解析法を用いて、SACにより誘発されるmRNA発現量を測定した。その結果、肝再生時に発現し癌原遺伝子であるc-mycがSAC刺激により有意の増加したことが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度の結果より、初代培養肝実質細胞においてSACがIGF-Iの分泌を促進させたことが示唆された。そこで、本年度はELISA法を用いてSAC刺激後の培養液中のIGF-I量を定量した。IGF-I分泌機構についてはSACと特異的シグナル伝達因子阻害薬を併用することにより検討した。SACによるIGF-I分泌効果およびその作用メカニズムは、「研究実績の概要」に示したように、概ね順調に進展している。SACによるIGF-I分泌効果はELISA法だけでなく、蛍光イメージングについても検討することができた。
昨年度に引き続きWestern blot法を用いたSACによるタンパク質リン酸化活性についても検討し、昨年度のERK2に加えSACによるJAK2、PLCおよびIGF-I RTKリン酸化についても測定することができた。加えて、SACによる細胞内Ca2+濃度の上昇もCa2+イメージングにより実証することができ、これらの結果より、SACが肝実質細胞においてJAK2→PLC→Ca2+の順にシグナルを伝達し、IGF-Iの分泌を促進させたことを明らかにすることができた。
さらに本年度は、蛍光イメージングによりSACがどの受容体を刺激し、JAK2/PLC経路を活性化させているのかも検討することができ、SACが成長ホルモン受容体を刺激することによりJAK2/PLC/Ca2+を介することも実証することができた。
上記の検討に加えて、リアルタイムPCR解析法を用いた遺伝子発現についても測定した。結果として、癌原遺伝子で細胞増殖に影響を及ぼすc-mycがSAC刺激後の肝実質細胞において、有意に増加することが明らかとなった。次年度はその他の癌原遺伝子（c-fosやc-junなど）だけでなく、細胞周期に関連する因子（cyclin AおよびB）やアドレナリン受容体（α、β）についても測定する。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、SACの肝実質細胞増殖促進作用が、交感神経系のα1作動性増強かβ2作動性増強か、もしくはその両方の作動性増強を受けるかを検討する。例えば、β2作動薬であるメタプロテレノールとSACを併用した場合、SAC単独よりもさらに細胞増殖効果が促進されるのか、β2作動性シグナルのどの因子（サイクリックAMPやプロテインキナーゼA）が関与するのか、また、それらの因子がSACの増殖シグナルのどの因子と相互作用するのか（JAK2、PLC、IGF-I RTK、ERK2など）について、肝細胞核のカウントやWestern blot法によるタンパク質リン酸化活性の測定を行う。α1作動性シグナルについても同様の方法で検討する。
また、リアルタイムPCR解析法によるmRNA発現量を測定も引き続き検討する。主に、c-fos、c-jun、 cyclin AおよびB、アドレナリン受容体（α、β）などを測定する。
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