| 研究課題/領域番号 |
20K16111
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
小林 しおり 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 特命助教 (60747905)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 抑制性ニューロン / GABAニューロン / グリシンニューロン / 神経の発生 / 遺伝子改変マウス |
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| 研究実績の概要 |
抑制性ニューロンにはGABAニューロンとグリシンニューロンが知られている。これまで、GABA作動性神経終末とグリシン作動性神経終末を免疫組織学的手法を用いて標識することにより脊髄の発達を明らかにしてきたが、それぞれの細胞体がどこから分化しどのように移動するのか、またどのように関わりあうのか、不明な点が多い。本研究では、遺伝子改変マウスを用いてGABAニューロンとグリシンニューロンを可視化し脳幹における発生過程を追うことで、抑制性ニューロンの分化と移動を明らかにする。そのために、GABAニューロン特異的に緑色蛍光タンパク質(GFP)が発現するGAD67-GFPノックインマウスを作製し、胎児期の脊髄と脳幹における発現分布を調べた。この結果は、International journal of molecular sciencesに掲載された。次に、グリシンニューロン特異的に赤色蛍光タンパク質(tdTomato)を発現するGlyT2-Cre/VGAT-stop-tdTomatoダブルトランスジェニックマウスを作製した。LEDライトを用いてサンプリング時に野生型と区別することができ、これはジェノタイピングの結果とも一致した。ただしadult個体では目視での判別が難しかった。胎齢期の脳幹についてはグリシンニューロンを三叉神経核や前庭神経核など複数の脳神経核で確認することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度と比べ、GlyT2-creノックインマウスとVGAT-stop-tdTomatoレポーターマウスを安定して系統維持し、GlyT2-Cre/VGAT-stop-tdTomatoダブルトランスジェニックマウスをサンプリングすることができている。また、固定液による自家蛍光が課題となっていたが、固定の時間を最小限にすることで厚さ20umの凍結切片でもグリシンニューロンを確認することができた。胎齢18日目と胎齢15日目の脳幹で、三叉神経核や前庭神経核においてグリシンニューロンを確認できた。一方脊髄に関しては後角ではグリシンニューロンを確認できたが、前角でははっきり区別することが難しかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
GlyT2-Cre/VGAT-stop-tdTomatoダブルトランスジェニックマウスを用いたグリシンニューロンの脳幹における発生過程を詳細に記録する。当初予想したよりも多くの脳神経核でグリシンニューロンが発現していたため、いくつかの神経核に的を絞ってGABAニューロンの発生過程と比較する。また、胎齢期の発達に加え、生後発達におけるグリシンニューロンの分化や移動を調べる。さらに、発生過程においてGABAニューロンとグリシンニューロンのがどのように関わりを持つか解析する。方法としては、GAD67-GFPマウスとGlyT2-Cre/VGAT-stoptdTomatoマウスを交配させ、ダブルレポーターマウスGAD67GFP/GlyT2Tomatoマウスを作製する。GABAニューロンはGFP、グリシンニューロンはtdTomatoで標識され、発生過程における相互関係を追うことができる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナの影響で、学会がオンライン開催であったことなどが次年度使用額が生じた理由としてあげられる。当該年度では遺伝子改変マウスの作製を順調に進めている。次年度からは、遺伝子改変マウスの作製に加え研究を論文にまとめていくため、マウスの購入やジェノタイピング用の試薬のほか、学会参加や論文投稿や校正に助成金を使用する計画である。
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