| 研究課題/領域番号 |
20K16330
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
佐田 遼太 大阪大学, 医学系研究科, 特任助教(常勤) (60869783)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | DKK1 / CKAP4 / FOXM1 / Wnt / 膵がん / 食道がん / 肝細胞癌 |
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| 研究実績の概要 |
我々はWntシグナル制御因子である分泌蛋白DKK1の新規細胞膜受容体CKAP4を同定し、種々のがんにおいてDKK1-CKAP4シグナルによるWntシグナルと独立した細胞増殖機構を明らかにしてきた。一方、がんにおけるDKK1過剰発現の機構及び腫瘍微小環境におけるDKK1の機能については十分な解析が進んでいない。私共はDKK1高発現膵がん由来細胞株S2-CP8細胞においてDKK1ノックアウトで発現が低下し、DKK1のレスキュー実験で発現が促進される遺伝子をRNAシーケンスで網羅的に解析し転写因子FOXM1に着目した。複数の膵がん・食道扁平上皮がん由来細胞株を用いた実験で、FOXM1がDKK1-CKAP4経路下流でAKTの活性化を介して発現促進されること、またこれらの細胞株においてFOXM1のノックダウンを行うことでDKK1の発現が低下することを明らかにした。ゲノムにおけるDKK1遺伝子の5’上流領域にFOXM1結合コンセンサス配列が存在することが確認された。これらの結果から、膵がん・食道扁平上皮がんにおいてDKK1-CKAP4シグナルの下流で転写因子FOXM1の発現が制御され、またDKK1がFOXM1のターゲットとして発現制御されるポジティブフィードバック機構が示唆された。
我々はHydrodynamic Tail vein injection(HTVi)法を用いて正常免疫マウス肝臓に活性型変異βカテニン、c-METなど複数のがん遺伝子と合わせてDKK1遺伝子を導入し、肝内に多発腫瘍形成を誘導するDKK1高発現肝がんモデルマウスを作製した。同マウス由来腫瘍を用いた組織免疫染色においてDKK1の過剰発現を確認し、血漿ELISAにおいてDKK1が血中に分泌されていることを確認した。腫瘍標本の組織免疫化学染色において腫瘍内に浸潤する免疫細胞および微小血管構造の評価が可能であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では2年間の研究期間で、①各種ヒトがんにおけるDKK1-CKAP4シグナルとFOXM1との関連②DKK1高発現マウスがんモデルの確立③正常免疫マウスに誘導したDKK1高発現マウスがんモデルの腫瘍微小環境におけるDKK1の機能を明らかにすることを目的としている。初年度では①膵がん・食道扁平上皮がん由来細胞株において転写因子FOXM1がDKK1-CKPA4シグナル下流においてAKTの活性化を介して発現促進されていること、また同細胞株において逆にDKK1自身がFOXM1依存性に発現制御を受けていること、ゲノムにおけるDKK1遺伝子の5’上流領域にFOXM1の結合コンセンサス配列が存在することを明らかとした。また、HTVi法をもちいてマウス肝臓にDKK1遺伝子を導入することに成功し、DKK1過剰発現肝腫瘍モデルマウスを確立した。導入したDKK1遺伝子の発現を組織免疫化学染色およびELISAにて確認し、腫瘍微小環境に関して組織免疫化学的評価が可能であることを確認した。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の研究計画を継続しながら、得られた研究成果を基に以下の解析を行っていく。
１）ゲノム上でDKK1遺伝子の5’上流領域に確認されたFOXM1結合コンセンサス配列に関して、クロマチン免疫沈降実験によって実際に同領域にDKK1が結合するか確認する。２）Crispr-Cas9法を用いて膵がん細胞株ゲノム上のDKK1遺伝子5'上流領域よりFOXM1結合領域を欠損させた細胞を作製し、DKK1の発現量および細胞増殖能がどのように変化するか確認する。
３）ヒト膵がん・食道扁平上皮がん臨床検体に対してDKK1、FOXM1の組織免疫染色を行い、ならびに同症例の臨床情報を用いて、がんにおけるDKK1とFOXM1の共発現の臨床的意義を明らかにする。
４）DKK1高発現肝細胞がんマウスモデルにおいて、DKK1が腫瘍増殖能や腫瘍転移能、腫瘍微小環境における免疫応答・血管新生に及ぼす影響を、複数のがん遺伝子との組み合わせで検討する。具体的には、HTVi法において様々ながん遺伝子とDKK1をマウス肝臓に導入し腫瘍を形成させ、DKK1依存性に腫瘍の形質が変化する分子機構を網羅的解析によって明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度から動物実験に用いる免疫不全マウス・通常免疫マウスが必要である。また生化学的解析に用いる試薬、組織免疫化学的解析に用いる抗体試薬が必要であり、消耗品費として使用する予定である。
肝細胞癌モデルマウス由来の肝腫瘍に対して、RNAシーケンスや次世代シーケンサーを用いたGWS解析、FACS法を用いた細胞分離と一細胞RNAシーケンスなど、網羅的解析を行っていく計画であり、それらを外注する費用として使用する予定である。
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