2021 年度実施状況報告書

細胞骨格を介した細胞運動極性の制御による骨軟部肉腫の転移抑制

研究課題

研究課題/領域番号	20K16353
研究機関	富山大学
研究代表者	渡邉健太富山大学, 附属病院, 診療助手 (90865255)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	細胞運動極性 / 細胞骨格転 / 転移抑制
研究実績の概要	本研究の目的は、マウス骨軟部肉腫細胞から樹立した転移能の異なる転移株を用い、転移能と細胞骨格の関連に着目し、新たな転移抑制法の創成である。研究の方法は、細胞骨格について特に細胞運動の極性に注目し、微小管プラス端集積タンパクによる細胞運動の調整メカニズムを解析することを計画した。本年度は昨年に続き転移能の異なる軟部肉腫細胞株と骨肉腫株を用いて2次元、3次元で培養し、細胞の運動を観察した。高転移能を持つ細胞株では低転移能をもつ細胞株より2次元ではスクラッチアッセイにて細胞運動能が高く、3次元培養ではコロニーの広がりが大きい結果であり、運動能の違いを認めた。また、2次元培養した細胞に対して微小管を細胞免疫染色を行い、画像解析をすることで微小管の長さを測定して比較することができた。これまでのことにより細胞運動と細胞骨格の変化を安定して検討することができるようになった。細胞極性をスクラッチアッセイを行い移動している細胞に対して微小管形成中心を細胞免疫染色することによって検討した。細胞はスクラッチにて欠損した方向へ極性をもって細胞運動していたが、微小管阻害薬であるエリブリンを投与すると細胞極性の一方向性が失われているこ結果であった。以上のことから微小管の評価、細胞運動の極性を安定して評価できるようになった。現在微小管プラス端集積タンパクのノックダウン株の作成を行っているところである。ノックダウンした細胞株を作ることで微小管プラス端集積タンパクが細胞運動に直接関与しているか検討することができると考えている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 2次元培養、3次元培養での細胞運動の評価、細胞免疫染色による細胞運動の極性評価は安定して可能となった。現在軟部肉腫細胞株、骨肉細胞株の高肺転移株に対して微小管ブラス端集積タンパクのノックダウン株を作成しているがうまくトランスフェクションができず、その先の解析ができていない。
今後の研究の推進方策	軟部肉腫細胞株に関してはもともとトランスフェクションしにくい細胞株であり、トランスフェクション以外にウイルスベクターを用いたインフェクションや過去にこの細胞に遺伝子導入した実績のあるクリスパーキャス９を用いてノックダウン、ノックアウト細胞株を作成し研究を進める。細胞運動、極性の評価は現在安定してできているため、ノックダウン細胞株を作成すれば研究を安定して進めることができると考えている。
次年度使用額が生じた理由	動物実験を実施する予定でいたが、昨年度からのin vitroの実験遅れの挽回にとどまり、動物実験に係る出費がなかったため次年度使用額が生じた。R4年度は動物実験に使用する計画である。