がん骨転移を引き起こすmicroRNAの探索とliquid biopsyへの応用

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K16357
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 川上 洋平 神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (50626570)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: がん骨転移 / miRNA / エクソソーム / 破骨細胞 / 骨破壊

研究実績の概要

がん骨転移による骨破壊は様々な骨関連事象を引き起こし、患者QOLの低下につながるため、早期発見・治療が重要だが、骨転移のメカニズムは十分には解明されていない。近年、細胞から分泌されるエクソソーム中のmiRNAが生体機能に様々な影響を及ぼしており、がん骨転移や骨破壊にも関与していることが示唆されている。本研究の目的は、がん骨転移における骨破壊や破骨細胞活性におけるmiRNAの影響を検討する事である。
ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231にGFP（コントロール）、miR-16、-133a、-223をプラスミド導入し、各導入細胞の培養上清（miR-CM）中の溶骨性因子の発現をReal-time PCRで評価した。MDA-MB-231細胞における溶骨性因子の発現は、miR-16-CMで上昇し、miR-133a-CM、miR-223-CMで低下する傾向を認めた。またRAW264.7細胞株でのRANKL刺激による破骨細胞分化課程において、各miR-CMでの培養を行った所、miR-16-CM添加群で破骨細胞活性が高く、形態も維持される傾向を認めた。また、象牙培地上で破骨細胞を培養し、吸収窩を測定するBone resorption assayを行い、骨吸収能は，miR-16-CM存在下で上昇、miR-133a/223-CM存在下では低下する傾向を認めた。In vivo では、miRNAを導入した乳癌細胞を6週齢ヌードマウスの脛骨近位に移植し，骨転移モデルを作成し、4週後に骨破壊の程度をμCTや組織学的(HE、TRAP、免疫染色)に評価を行い、miR-16群で骨破壊像が顕著な傾向を認めた。
本研究の結果から、miR-16が、がん骨転移における骨破壊を増悪させ、miR-133a、miR-223は抑制的に作用する可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究のこれまでの結果から、miR-16の過剰発現によりヒト乳癌細胞株MDA-MB-231の培養上清中の溶骨性因子の発現増強を認め、また培養上清での破骨細胞形態が維持されており、miR-133a、miR-223ではそれらが抑制されていたことから、前者ががん骨転移における骨破壊を増悪させ、後者は抑制的に作用する可能性が示唆された。さらなる検討により、がん骨転移の骨破壊におけるmiRNAの機能解明や治療標的探索に繋がる可能性があると考えられた。
現在、各miR-CMが破骨細胞へ与える影響の検討として、象牙培地上で破骨細胞を培養し、吸収窩を測定するBone resorption assayを行い、骨吸収能は，miR-16-CM存在下で上昇、miR-133a/223-CM存在下では低下する傾向を認めている。In vivo では、miRNAを導入した乳癌細胞（MDA-MB-231，1.0x106cells）を6週齢ヌードマウスの脛骨近位に移植し，骨転移モデルを作成し、4週後に骨破壊の程度をμCTや組織学的(HE、TRAP、免疫染色)に評価を行い、miR-16群で骨破壊像が顕著な傾向を認めた。
In vitro, in vivoいずれの検討においてもmiR-16の過剰発現によりMDA-MB-231における溶骨性因子の発現が増強し、破骨細胞分化・活性が亢進することが確認され、一方miR-133a・-223では逆の結果が得られたことから、miRNA-16は、破骨細胞の機能制御を介して、乳癌骨転移による骨破壊を促進する可能性があると考えられ、In vivoでの実験系へ進める事ができ概ね順調に進んでいると考える。

今後の研究の推進方策

miRNAを導入した乳癌細胞（MDA-MB-231，1.0x106cells）を6週齢ヌードマウスの脛骨近位に移植し，骨転移モデルを作成し、術後4週後に脛骨及び周囲の腫瘍浸潤組織、転移性腫瘍を摘出して組織標本を作製している。今後、サンプル数を増やし、骨破壊の程度を骨量（μCT）免疫組織学的評価（HE染色，TRAP染色，免疫染色(IL-1b、IL-6、RANKL、TNF、PTHrP)、細胞増殖に関しては抗Ki67抗体を用いた免疫組織化学的に解析を行い、臨床応用のために重要な骨転移のメカニズムの解明と抑制系miRNAを用いた転移抑制治療法の開発を目指す予定である。
また、破骨細胞以外の、骨芽細胞や間質細胞への影響も検討し、数多く存在する他のmiRNAとの相互作用について検討を行う予定である。
これまでのin vitro、 in vivoでの研究でmiR-16群では骨破壊亢進、骨量低下、破骨細胞数の増加、溶骨性因子の発現増強を認めており一方miR-133a・223群では骨破壊抑制、骨量増加、破骨細胞数の減少、溶骨性因子の発現低下を認めており、これらのmiRNAが，乳癌骨転移の骨破壊に対するバイオマーカーや治療標的となる可能性があり、さらに実験をすすめていく予定である。

次年度使用額が生じた理由

新型コロナウイルス（COVID-19）の拡大に伴い、学会活動の制限が生じ、また動物舎の使用制限に伴い、スケジュールを一部変更せざるを得なかったため次年度使用額が生じた。使用計画としては、In vivoでの実験を実験計画に沿ってすすめるとともに、得られた研究成果を国際学会等で順次報告する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Regulatory roles of miRNAs 16, 133a, and 223 on osteoclastic bone destruction caused by breast cancer metastasis (2021)
  • 著者名/発表者名: Kazumichi Kitayama, Teruya Kawamoto, Yohei Kawakami, Hitomi Hara, Toshiyuki Takemori, Shuichi Fujiwara, Shunsuke Yahiro, Tomohiro Miyamoto, Yutaka Mifune, Yuichi Hoshino, Kenichiro Kakutani, Tomoyuki Matsumoto, Takehiko Matsushita, Takahiro Niikura, Ryosuke Kuroda, Toshihiro Akisue
  • 雑誌名: Int J Oncol 巻: 59(5) ページ: 97
  • DOI: 10.3892/ijo.2021.5277
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] The regulatory roles of miRNAs 16, 133a, and 223 on osteoclastic bone destruction by breast cancer metastasis (2022)
  • 著者名/発表者名: 北山和道、河本旭哉、原仁美、深瀬直政、川上洋平、竹森俊幸、藤原周一、八尋俊輔、黒田良祐、秋末敏宏
  • 学会等名: Orthopaedic Research Society 2022 Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] 乳癌骨転移における骨破壊に寄与するmiRNAの探索 (2021)
  • 著者名/発表者名: 北山和道、河本旭哉、原仁美、深瀬直政、川上洋平、竹森俊幸、藤原周一、八尋俊輔、宮本智弘、黒田良祐、秋末敏宏
  • 学会等名: 第54回 日本整形外科学会骨・軟部腫瘍学会学術集会
• [学会発表] 乳癌骨転移による骨破壊に寄与するmiRNAの検討 (2021)
  • 著者名/発表者名: 北山和道、河本旭哉、原仁美、深瀬直政、川上洋平、竹森俊幸、藤原周一、八尋俊輔、宮本智弘、黒田良祐、秋末敏宏
  • 学会等名: 第36回日本整形外科学会基礎学術集会