| 研究課題/領域番号 |
20K16593
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
光澤 志緒 東北大学, 医学系研究科, 大学院非常勤講師 (60869618)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 筋萎縮性側索硬化症 / TARDBP / TDP-43 / iPS細胞 / 運動ニューロン脆弱性 / PHOX2B |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、筋萎縮性側索硬化症（ALS）の運動ニューロン選択的変性の原因解明を目標に、その解剖学的な特徴である長大な軸索に着目し、運動ニューロン選択的変性について解析する。
ALSの原因遺伝子のひとつであるTARDBPはTDP-43をコードし、TDP-43はほとんどのALS患者の運動ニューロンの細胞体に異常凝集する重要な病態関連分子である。昨年度までに、TARDBP変異ALS患者の人工多能性幹細胞（iPS細胞）を樹立し、分化誘導した変異運動ニューロンの突起伸長が抑制されることを確認した。さらに、RNAシークエンスにより変異運動ニューロン軸索で発現が低下している新規病態関連因子PHOX2Bを見出し、その発現抑制で健常者運動ニューロンやゼブラフィッシュ脊髄軸索の伸長抑制が再現された。PHOX2Bは、ALSで発症後長期まで保たれる動眼神経や自律神経において発現が高いことから、変異運動ニューロンの選択的変性に関わる可能性が考えられた。さらなる研究として、PHOX2Bの下流に位置する標的因子の同定を目的としたPHOX2B発現抑制神経細胞のRNAシークエンスを行ったが、優位な変動を示す遺伝子群は検出されなかった。運動ニューロン内ではPHOX2Bは厳格に制御されていることが示唆された。
本年度は、外的介入によらないPHOX2Bの下流標的の解析として、PHOX2Bを多く含む自律神経などと運動ニューロンとのRNA比較解析を行うこととした。既報告を基に、健常者由来iPS細胞とALS患者TARDBP変異を導入したアイソジェニックラインiPS細胞を自律神経ニューロンへ分化誘導し、各種マーカーの発現を免疫細胞化学等で確認した。また、iPS細胞由来自律神経ニューロンのRNAシークエンスを実施した。
次年度は、RNAシークエンスの解析からPHOX2B下流標的遺伝子の同定、RNAやタンパク発現などの評価を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
申請書内の実験計画である、「3.1 ヒトiPS細胞アイソジェニックラインを用いた新規病態関連因子X（=PHOX2B）の再現性の確認」、「3.2 in vitroでの新規病態関連因子X（=PHOX2B）の過剰発現実験」、「3.3 in vivoでの新規病態関連因子X（=PHOX2B）の過剰発現・発現抑制実験」のすべての計画を、昨年度までに実施、評価を行い、結果の一部をオープンアクセス誌Stem Cell Reportsに報告した。iPS由来運動ニューロンにGFPタグ付きPHOX2B発現レンチウイルスベクターを感染させることで試みた過剰発現実験では、PHOX2B-GFP容量依存的に発現が上昇する一方で内因性のPHOX2Bの発現が減少しており、PHOX2B過剰発現実験は困難であった。
次に、PHOX2Bの下流標的因子を特定するために神経芽細胞腫由来細胞を用いたPHOX2B発現抑制細胞のRNAシークエンスを行ったが、優位な変動を示す遺伝子群は検出されなかった。ニューロン内ではPHOX2Bは厳格に制御されており、過剰発現や発現抑制実験のみではPHOX2Bの下流標的因子の特定は難しいと考え、本年度は、PHOX2Bを多く含みALSで発症後期まで保たれる自律神経と運動ニューロンとの比較で下流標的因子の候補を見出すこととした。既報告（Kirino, et al. Sci Rep. 2018）を基に微修正したプロトコールを用いて自律神経の分化誘導を行った。分化誘導効率は、誘導後細胞の免疫細胞化学、および上記既報告の著者らより分与いただいたPHOX2Bプロモーター下にeGFPを発現するレポーター細胞であるPHOX2B::eGFP細胞の誘導後のGFP陽性率により評価し、高い誘導効率を得た。iPS由来自律神経ニューロンを、運動ニューロンと同様に細胞体と軸索に分けてRNAシークエンスを実施した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、PHOX2Bがどのように運動ニューロン変性を来すかの解明を目標に、転写因子PHOX2Bの下流の標的因子の同定を行い、下流標的因子への治療として介入可能性を検討したい。上述のように、昨年度は、患者iPS細胞をALS進行期にも比較的保たれる自律神経などへ分化誘導しRNAシークエンスを実施したため、本年度で自律神経と運動ニューロンとの間で発現パターンを比較検討することで、PHOX2Bの下流標的因子の検索を行う。
また、転写調節領域を特定し、レポーター・アッセイで発現調節を明らかにする。さらに、PHOX2Bと運動ニューロン脆弱性をつなぐPHOX2Bの下流標的因子が軸索でどのように働いているかを確認するために、Puromycinで新規翻訳タンパクを標識し、免疫沈降サンプルを用いたプロテオーム解析を実施する。翻訳量に差が出るタンパクおよびタンパク複合体を特定し、PHOX2Bの下流標的因子のタンパクレベルでの発現や働きを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
申請時に計画した研究の結果から得られた仮説を基に、次年度以降も本研究を継続するため。
使用計画として、①自律神経などの運動ニューロン以外の神経細胞と運動ニューロンの軸索におけるRNA発現比較、②新規病態関連因子PHOX2Bの下流候補のRNA発現やタンパク発現量解析を行う。また、PHOX2B標的遺伝子の転写調節領域を特定し、レポーター・アッセイで発現調節を明らかにする。
上記実験計画遂行のために、iPS細胞を含めた細胞の維持、分化誘導に必要な培地、小分子などを購入する。またRNAシークエンスやそのデータ解析、タンパク発現量解析に必要な試薬を購入する。
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