2021 年度実施状況報告書

低酸素イメージングFRP-170-PETを用いたTH-302併用放射線治療の検討

研究課題

研究課題/領域番号	20K16717
研究機関	大阪大学
研究代表者	一瀬浩司大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (50832903)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	FRP170-PET / TH-302 / 腫瘍内低酸素 / 低酸素イメージング / 放射線治療
研究実績の概要	令和3年度は、18F-FRP170-PETにおける集積が腫瘍内低酸素分画の局在と一致するかを評価するために、蛍光免疫染色法を用いた組織学的検討を追加した。本検討には18F-FRP170-PETの撮像条件最適化の際に評価対象とした、ヒト舌癌細胞株SAS腫瘍移植マウスを用いた。18F-FRP170の投与から120分後にPETを撮像し、直後に各マウスに対してPimonidazole hydrochloride (Hypoxyprobe-1 Plus Kit; Hypoxyprobe Inc.) を60 mg/kgの容量で腹腔内投与し、60分後に十分な麻酔下で安楽死させ腫瘍を摘出した。腫瘍の凍結ブロックを作製し、マウスの横断面に一致した切片を作製した。切片をエタノールで固定し、ブロッキングの後、FITC-conjugated mouse anti Hypoxyprobe-1 (Hypoxyprobe-1 Plus Kit)を100倍希釈した溶液を添加し、室温で2時間反応させた。DAPI入りの封入剤を用いて対比染色及び封入を行い、蛍光顕微鏡を用いて切片を観察した。得られた組織所見をMRI横断像、及びPET横断像と比較した。異なる2匹のマウスから摘出した腫瘍検体について定性的な評価を行った。一方の検体では、腫瘍内部のpimonidazole陽性領域の分布がPETにおける集積の局在と類似した。他方の検体では、腫瘍内部に組織が脱落した領域を認め、これを取り囲むようにpimonidazole陽性領域が観察された。壊死とその周囲の低酸素領域ともとれる所見であったが、組織標本作製時に生じたアーチファクトとの判別が困難であった。いずれの検体においても、正常皮膚構造に緑色の蛍光が観察され、非特異的な抗体反応の存在が疑われた。標本作製方法、抗体反応条件についても再検討を要する結果であった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由令和2年度はマウスへの腫瘍移植方法を最適化するべく検討を重ね、複数の細胞株で腫瘍移植マウスモデルを安定して供給することが可能となった。また、青森県量子科学センターの小動物PET/MRI装置における18F核種のクロスキャリブレーションファクターを算出することにより、18F-FRP170-PETの集積をSUV値として定量評価することを可能とした。さらに同装置を用いて、ヒト舌癌細胞株SAS腫瘍移植マウスにおける腫瘍内および心腔内血液中のSUV値を比較することで18F-FRP170-PETの撮像タイミングの検討を行った結果、集積の評価は背景の洗いだしが良好な投与後120分で行うのが妥当であることが示唆された。また、SASを用いたin vitroの検討では、従来の低酸素毒tirapazamineに比べ、TH-302がより高い低酸素選択毒性を有することが確認された。令和3年度は、18F-FRP170-PETの集積が腫瘍内低酸素分画を反映し得るかを評価するために、蛍光免疫染色法を用いた組織学的検討を追加した。低酸素分画の同定にはFITCで標識された抗pimonidazole抗体を用いた。今年度は定性的な評価に留まったが、腫瘍内部のpimonidazole陽性領域の分布の一部が18F-FRP170-PETの陽性集積の局在と類似した。しかし、組織の挫滅や非特異的な抗体反応の存在が考えられ、標本作製方法や抗体反応条件について引き続き検討を要する。令和3年度は、研究代表者の一身上の都合により長期に渡り実験を遂行することが困難であった。そのため、研究実施期間の1年間延長を申請した。
今後の研究の推進方策	令和4年度は、青森県量子科学センターならびに南東北創薬・サイクロトロン研究センターを実験の場として、TH-302併用放射線治療の適応判断における18F-FRP170-PETの有用性を検討する。令和3年度の組織学的検討では、pimonidazole陽性領域の分布が18F-FRP170-PETの集積と類似する可能性が示唆されたものの定性的な評価に留まった。画像解析ソフトウェアを用いた定量化法により、低酸素領域のスコア化を目指す。また、抗pimonidazole抗体の非特異的反応の存在を示唆する所見が観察されており、蛍光免疫染色における抗体反応条件や洗浄方法の最適化を行う。次に、18F-FRP170-PETでの集積比率によってTH-302の放射線治療への増感効果に差が生じ得るかを評価する。18F-FRP170-PETの集積によって分類した低酸素分画高比率群と低比率群の2グループ間において、TH-302併用の有無による腫瘍抑制の上乗せ効果を比較することで、TH-302併用放射線治療の抗腫瘍効果が腫瘍内低酸素分画の比率に依存するかを検討する。さらに摘出腫瘍組織の切片を作製し、DNA損傷マーカーを用いた免疫染色を行うことで、TH-302併用放射線治療の抗腫瘍効果の背景に、X線照射単独では制御困難な低酸素細胞のDNA損傷に基づく殺細胞効果が存在することを示す。
次年度使用額が生じた理由	研究代表者の一身上の都合により長期に渡り実験の遂行が困難であったため当該助成金が生じた。当該助成金は次年度の研究における物品購入に充てる。また、次年度は青森県量子科学センターならびに南東北創薬・サイクロトロン研究センターを実験の場とする予定である。現在、研究代表者は大阪府を生活圏としている。そのため、大阪府から上記研究施設への旅費としても一部使用したく考えている。