2020 年度実施状況報告書

エクソソームプロファイリングによるダウン症候群の肺高血圧症発症病態の解明

研究課題

研究課題/領域番号	20K16854
研究機関	大阪大学
研究代表者	杉辺英世大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (30791595)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	ダウン症候群 / iPS細胞 / エクソソーム / 肺高血圧症
研究実績の概要	我々の研究室で確立したダウン症候群患者iPS細胞と、Cre/loxP系を用いて、21番染色体トリソミーをダイソミーにコレクションしたラインを、isogenicラインとして実験に用いることとした。両者について、血管平滑筋細胞への分化誘導については、既報の方法（Patsch et al. Nat Cell Biol.2015;17:994-1003）を用いて行い、血管内皮細胞への分化誘導についてはTakara MiraCell; iPS　Cell to Endothelial Cell Differentiation Kitを用いて行った。これらの細胞をサブコンフルエントまで増殖させ、その後エクソソームフリーの無血清培地に交換し、24時間後に培養上清を回収した。エクソソームの回収については、これまで多くの報告があるが、我々は超遠心を用いた方法で行った。回収したエクソソームについては、そのサイズ分布についてqNANOを用いたナノトラッキング解析にて確認した。また、CD63, Tsg101, Synteninなどのエクソソームマーカーをウエスタンブロットで確認した。これらのエクソソームからmiRNAを含むRNAの回収を行い、現在、その解析を本学微生物病研究所内にある、遺伝情報研究センターにて行っている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由エクソソームの回収は行っており、そのクウォリティチェックも行っている。現在はエクソソーム内に含まれるsmall RNAやlong noncoding RNAについてのシークエンス解析を行っているところである。
今後の研究の推進方策	RNA-seq解析結果をもとに、ダウン症候群由来の血管内皮細胞や血管平滑筋細胞における、特徴的なエクソソームプロファイルについての同定を行う。同定されたmiRNAやlncRNAの機能解析を行い、ダウン症候群患者における肺高血圧や血管機能低下の病態にどのように関わっているのかについての機能解析実験を行っていく予定である。